VEGF-C、VEGF-D及其受体Flt-4在胰腺癌中的表达及意义

李智峰，李高强，田云霄，袁艳龙，司华鹏，梁冰锋

（1.河北省邯郸市第一医院普外一科，河北邯郸 056002；2.河北省邯郸市中心医院病理科，河北邯郸 056001；3.河北女子职业技术学院护理系，河北石家庄 050091）

VEGF-C、VEGF-D及其受体Flt-4在胰腺癌中的表达及意义

李智峰1，李高强1，田云霄2，袁艳龙2，司华鹏1，梁冰锋3

（1.河北省邯郸市第一医院普外一科，河北邯郸 056002；2.河北省邯郸市中心医院病理科，河北邯郸 056001；3.河北女子职业技术学院护理系，河北石家庄 050091）

目的探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-C、VEGF-D及fms-like tyrosine kinase-4（Flt-4）蛋白在胰腺癌组织中的表达及与胰腺癌临床病理特征之间的关系。方法选择根治性手术切除的胰腺癌组织63例及正常胰腺组织13例。采用免疫组织化学法（Envision法）检测胰腺癌组织及正常胰腺组织中VEGF-C、VEGF-D的表达，检测癌周组织及正常胰腺组织中Flt-4的表达，并结合患者的临床病理特征进行统计学分析。结果63例胰腺癌组织中VEGF-C阳性表达38例（60.3%）、VEGF-D阳性表达40例（63.5%）、癌周Flt-4阳性表达41例（76.2%），均高于正常胰腺组织（P＜0.05）。VEGF-C、VEGF-D和Flt-4的高表达均与淋巴结转移及患者生存率密切相关（P＜0.05）。胰腺癌中VEGF-C、VEGF-D与癌周Flt-4蛋白的表达呈正相关（P＜0.05）。结论VEGF-C、VEGF-D在胰腺癌中表达增高，Flt-4在癌周组织中表达增高，表明它们与胰腺癌的生物学侵袭性行为有关。在胰腺癌中VEGF-C、VEGF-D均与Flt-4的表达呈显著正相关，并与淋巴结转移及患者生存期密切相关，表明VEGF-C、VEGF-D和Flt-4可以促使胰腺癌发生淋巴结转移，且在转移过程中有相互促进作用。

胰腺肿瘤；血管内皮生长因子类；免疫组织化学

胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，5年生存率仅3%左右，早期即有局部淋巴结转移，研究胰腺癌侵袭、转移的发生机制具有极其重要的临床意义。研究［1-2］表明，肿瘤生长、侵袭、转移与其血管及淋巴管新生有着密切联系，而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最关键的促血管和淋巴管生成因子，Flt-4（fms-like tyrosine kinase-4）作为VEGF的受体主要表达于淋巴管内皮。VEGF-C、D可选择性地作用于Flt-4受体促进血管淋巴管的增生，在肿瘤的淋巴转移中有着至关重要的作用。已有报道［3］证实VEGF及其受体在前列腺癌、胃癌、食管癌、大肠癌、乳腺癌等多种原发性肿瘤中存在异常表达，其表达水平与淋巴结转移明确相关。但其在胰腺癌中的表达及其与淋巴结转移的关系报道尚少。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集2005年1月—2009年1月河北省邯郸市第一医院及邯郸市中心医院肝胆外科行胰十二指肠切除并均经病理证实的胰腺癌病例63例，其中男性43例，女性20例，年龄37～79岁，平均59.7岁。淋巴结转移者25例，占39.7%；所有患者术前均未行任何抗癌治疗。术后失访4例，随访结束时仍存活9例，生存时间1～45个月，中位生存期11个月。癌周组织为距肿瘤边缘0.3～0.5cm，无癌细胞浸润。正常胰腺标本共13例，来自邯郸市第一医院病理科非胰腺疾病死亡者尸检存档蜡块，病理学检查证实全部为正常胰腺组织。

1.2 方法：采用免疫组织化学Envision法进行染色观察，兔抗人VEGF-C、VEGF-D及Flt-4单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Envision二抗等购自上海长岛公司。用已知的乳腺癌阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。结果判定，VEGF-C、VEGF-D主要表达于肿瘤细胞的胞浆，Flt-4主要表达于癌周毛细淋巴管内皮细胞，以细胞内含有棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞。每例切片至少计数10个/400倍视野，评分标准按Shimizu方法，≥3分为阳性。所有镜检及计数均由两位不了解患者临床病理特征的病理专家完成。

1.3 随访：观察至2012年1月，随访时间自手术之日开始，以死亡时间或随访结束截止，总生存时间为从手术之日到死亡时间或随访结束截止。

1.4 统计学方法：应用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，采用χ2检验，相关性采用Spearman等级相关分析。以随访结束为截止分析生存情况，采用Kaplan-Meier单因素生存分析计算患者生存率，生存率比较采用Log-Rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胰腺癌组织中VEGF-C、VEGF-D及Flt-4的蛋白表达：VEGF-C在13例正常胰腺组织中阳性表达3例（23.1%），在63例胰腺癌组织中的阳性（图1）表达38例（60.3%），胰腺癌组织阳性表达率明显高于正常胰腺组织（P＜0.05）。VEGF-D在13例正常胰腺组织中阳性表达3例（23.1%），在63例胰腺癌组织中的阳性（图2）表达40例（63.5%），胰腺癌组织阳性表达率明显高于正常胰腺组织（P＜0.05）。Flt-4主要表达于癌周淋巴管内皮细胞（图3），在13例正常胰腺组织中阳性表达4例（30.8%），在63例胰腺癌周围组织中的阳性表达41例（65.1%），胰腺癌组织阳性表达率明显高于正常胰腺组织（P＜0.05）。见表1。

2.2 VEGF-C、VEGF-D及Flt-4蛋白阳性表达与生存期的关系：63例患者中位生存期为11个月。有淋巴结转移组和无淋巴结转移组的中位生存期5个月和14个月；VEGF-C阳性和阴性表达的患者的中位生存7个月和16个月；VEGF-D阳性和阴性表达的患者的中位生存8个月和16个月；Flt-4蛋白阳性和阴性表达的患者的中位生存7个月和15个月。Kaplan-Meier单因素生存分析计算生存率，有淋巴结转移组的生存率明显低于无淋巴结转移组的生存率（P＜0.01）；VEGF-C、VEGF-D和Flt-4阴性患者生存率均高于VEGF-C、VEGF-D和Flt-4阳性的患者（P＜0.05），见表2。

表1 VEGF-C、VEGF-D和Flt-4在胰腺癌和正常胰腺组织中的表达Table 1 Exp ression of VEGF-C，VEGF-D andFlt-4 protein in pancreatic carcinoma，and norm al pancreatic tissue

2.3 胰腺癌组织中VEGF-C、VEGF-D和Flt-4阳性表达相关性及与淋巴结转移的关系：63例胰腺癌组织中VEGF-C、VEGF-D的高表达均与Flt-4蛋白的表达呈显著正相关（rs=0.425，0.413，P＜0.01）。VEGF-C与VEGF-D的表达无相关性（P＞0.05）。25例有淋巴结转移组中VEGF-C蛋白阳性表达21例（84%）、VEGF-D蛋白阳性表达23例（92%）、Flt-4蛋白阳性表达23例（92%），均显著高于无淋巴结转移组中的表达（P＜0.01）。见表3～5。

表2 VEGF-C、VEGF-D、Flt-4及淋巴结转移与胰腺癌患者生存率的关系Table 2 The expression of VEGF-C，VEGF-D，Flt-4 and lymph nodemetastasis in relation to themedian survival time of 63 patientsw ith pancreatic carcinoma

表3 Flt-4与VEGF-C及VEGF-D表达的相关性Table 3 Correlation between Flt-4 and VEGF-C or VEGF-D protein expression in 63 cases of pancreatic carcinom a

表4 VEGF-C与VEGF-D表达的相关性Table 4 Correlation between VEGF-C and VEGF-D protein expression in 63 cases of pancreatic carcinoma

表5 VEGF-C、VEGF-D及Flt-4的表达与淋巴结转移的关系Table 5 Expression of VEGF-C，VEGF-D and Flt-4 protein in relation to the lymph nodemetastasis

3 讨 论

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，近30年来发病率呈上升趋势（增长了3～7倍），其病死率居恶性肿瘤的第4位［4］。胰腺癌恶性程度高、发病隐匿、进展快、病死率高、预后差，5年生存率小于3%。淋巴结转移是导致其预后差的主要原因之一。近年来，VEGF家族因有促进血管淋巴管增生导致淋巴结转移的作用而备受关注。

VEGF家族由不同的剪接可产生VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及胎盘生长因子等5种不同的表现形式。VEGF-C和VEGF-D均具有特异性促进淋巴管内皮细胞增生的作用，被认为与肿瘤的淋巴管新生和淋巴结转移有密切关系［5］。VEGF-C、VEGF-D已经在多种不同的恶性肿瘤中被证实与淋巴结转移显著相关，如乳腺癌、胃癌［6-7］、胰腺癌等。Kurahara等［8］利用免疫组织化学染色法对58例手术切除的胰头导管腺癌标本VEGF-C、VEGF-D的表达率及其与淋巴结转移及患者预后等之间的关系进行了研究，癌组织中VEGF-C和D阳性表达组的淋巴结转移率明显高于阴性表达组，有淋巴结转移组的5年生存率明显低于阴性组，提示胰头癌组织中VEGF-C和D的表达与淋巴结转移及预后密切相关。

肿瘤周围组织被认为是瘤细胞扩散入淋巴管的最关键部位，其内高密度的血管淋巴管是肿瘤发生转移的基础［9］。我们在对Flt-4研究时发现，其主要阳性表达于癌周的毛细淋巴管内皮细胞胞浆，少量表达于毛细血管及胰岛细胞中。VEGF-C、VEGF-D表达升高可作用于受体Flt-4，使其表达升高，而促使淋巴管新生，且由于Flt-4调节生成的淋巴管缺乏完整的基膜，内皮细胞间的缝隙大，通透性较高［10］，再加上内皮细胞对肿瘤细胞的趋化作用［11］，加速了肿瘤细胞与淋巴管的接触的几率，造成转移。

本研究胰腺癌63例中VEGF-C阳性表达38例（60.3%），VEGF-D阳性表达40例（63.5%），Flt-4在胰腺癌周组织中的阳性表达41例（65.1%），均明显高于正常胰腺组织（P＜0.05），结果提示VEGF-C、VEGF-D和Flt-4的高表达参与了胰腺癌的发生和转移。随访发现有淋巴结转移组和无淋巴结转移组的中位生存5个月和14个月；VEGF-C阳性和阴性表达的患者的中位生存7个月和16个月；VEGF-D阳性和阴性表达的患者的中位生存8个月和16个月；Flt-4蛋白阳性和阴性表达的患者的中位生存7个月和15个月。生存曲线分析显示有淋巴结转移组的生存率明显低于无淋巴结转移组的生存率，VEGF-C、VEGF-D和Flt-4阳性性患者生存率均明显低于VEGF-C、VEGFD和Flt-4阴性患者，VEGF-C、VEGF-D和Flt-4均与胰腺癌的淋巴结转移有明显相关性。Log-Rank检验结果显示阳性患者与阴性患者之间的生存期存在差异，它们是独立性预测指标还是其预测性是通过淋巴结转移间接显示，尚有待于大样本多因素分析得出，但我们的研究结果强烈提示VEGFC、VEGF-D及Flt-4蛋白阳性表达可作为判断影响胰腺癌患者预后的一个重要指标［12］。此外，VEGF-C、VEGF-D的高表达均与Flt-4蛋白的表达呈显著正相关。

综上所述，淋巴结转移可作为胰腺癌患者独立预后的因素，而VEGF-C、VEGF-D和Flt-4在胰腺癌淋巴结转移过程中起到相互促进作用，从而影响胰腺癌患者的预后。因此，在临床上，检测VEGF-C、VEGF-D和Flt-4的表达率升高均可作为胰腺癌患者预后不良的预测因素。通过选择性阻断其通路可为胰腺癌的治疗带来希望［12-13］。

［1］ DALLAGOCH，OLIVEIRA MC，BARBOSA-COUTINHO LM，et al.Angio genesis in craniopharyngiomas：mier ovascular denisty and tissue expression of the vascular endothelial growth factor（VEGF）and endostatin［J］.Endocr Pathol，2005，16（4）：355-362.

［2］ AVETISON SE，MAMIKOIAN VR，SURGUCH BK，et al. Antiangiogenic therapy for choroidal neovascularization induced by age-related emacular dugeneration C preliminarv communication［J］.Vestn Oftalmol，2009，125（6）：3-8.

［3］ 李良，董勤，王茂春.VEGF与肿瘤关系的研究进展［J］.内蒙古医学杂志，2010，42（9）：1072-1075.

［4］ MULDER I，HOOGENVEEN RT，VAN GENUGTEN M，et al. Smoking cessation would suhstantially reduce the future incidence of pancreatic cancer in the European Union［J］.Gastroenterol Hepatol，2002，14（12）：1343-1353.

［5］ MAEDA S，SHINCHI H，KURAHARA H，et al.CD133 expression is correlated with lymph nodemetastasis and vascular endothelial growth factor-C expression in pancreatic cancer［J］. Br JCancer，2008，98（8）：1389-1397.

［6］ JUNGHC，YOUNG HO，YONGWP，etal.Correlation of vascular endothelial growth factor-D expression and VEGFR-3-positive vessel density with lymph node metastasis in gastric carcinoma［J］.JKorean Med Sci，2008，23（4）：592-597.

［7］ ARIGAMI T，NATSUGOE S，UENOSONO Y，et al.Vascular endothelial growth factor-C and-D expression correlates with lymph node micrometastasis in pN0 early gastric cancer［J］.J Surg Oncol，2009，99（3）：148-53.

［8］ KURAHARA H，TAKAO S，MAEMURA K，et al.Impact of vascular endothelial growth factor-C and-D expression in human pancreatic cancer：its relationship to lymph node metastasis［J］.Clin Cancer Res，2004，10（24）：8413-8420.

［9］ 陈元文，钱学华.VEGF-C表达和淋巴管生成与胰腺癌淋巴道转移的关系［J］.重庆医科大学学报，2005，30（4）：540-543.

［10］ MARSCHALL Z，SCHOLZ A，STACKER SA，et al.Vascular endothelial growth factor-D induces lymphangiogenesis and lymphatic metastasis in models of ductal pancreatic cancer［J］. Int JOncol，2005，27（3）：669-679.

［11］ LUCIE K，TANJA V，VALENTIN G，et al.Distinct roles of vascular endothelial growth factor-d in lymphangiogenesis and metastasis［J］.Am JPathol，2007，170（4）：1348-1361.

［12］ DANIEL BC，ERIC HJ，ASHOK KS，et al.Molecular targeted thrapies for pancreatic cancer［J］.Am J Surg，2008，196（3）：430-441.

［13］ LIU X，ZHANG M，GO VL.Membrane proteomic analysis of pancreatic cancer cells［J］.JBiomed Sci，2010，17（1）：74.

（本文编辑：赵丽洁）

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF VEGF-C，VEGF-D AND IT′SRECEPTOR Flt-4 IN HUMAN PANCREATIC CARCINOMA

LIZhifeng1，LIGaoqiang1，TIAN Yunxiao2，YUAN Yanlong2，SIHuapeng1，LIANG Bingfeng3
（1.Department of Surgery，the Frist Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056002，China；2.Department of Pathology，The Central Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056001，China；3.Department of Nursing，HebeiWomen′s Vocational College，Shijiazhuang 050091，China）

ObjectiveTo evaluate the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）-C，VEGF-D and fms-like tyrosine kinase-4（Flt-4）in pancreatic cancer，and analyze the relationships between the expression and the clinicopathological characteristics of pancreatic carcinoma.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of VEGF-C，VEGF-D and Flt-4.Statistical analysis was used to determine the relationship between the expression and clinicopathological parameters of pancreatic Carcinoma.ResultsThe positive rates of VEGF-C and VEGF-D in pancreatic carcinoma were 60.3%（38/63）and 63.5%（40/63），which were significantly higher than the positive rates 23.1%（3/13）and 23.1%（3/13）in normal pancreatic tissue respectively（P＜0.05）.The positive rates of Flt-4 in paraneoplastic and normal pancreatic tissue were 76.2%（41/63）and 30.8%（4/13）respectively（P＜0.05）.The expressions of VEGF-C and VEGF-D in pancreatic carcinoma were correlated positively with the expressions of Flt-4 in paraneoplastic tissue（P＜0.05）.The overexpression of VEGF-C，VEGF-D and Flt-4 in pancreatic cancerwere correlated significantly with lymph node metastasis and survival time of patients（P＜0.05）.ConclusionThe expression of VEGF-Cand VEGF-D in pancreatic cancer increases，so does the expression of Flt-4 in cancer tissues，which indicate that they are related to the biology invasive behavior of pancreatic cancer. In pancreatic cancer，both the expression of VEGF-C and VEGF-D are positively correlated with the expression of Flt-4 significantly，furthermore，they are closely linked with lymph node metastasis and patient survival，indicating that VEGF-C，VEGF-D and Flt-4 can provide pancreatic cancer with lymph node metastasis，and havemutual promotion in the process ofmetastasis.

pancreatic neoplasms；vascular endothelial growth factors；immunohistochemistry

R735.9

A

1007-3205（2012）08-0890-04

2012-01-17；

2012-04-07

河北省科技厅科学技术支撑项目（09276153）

李智峰（1976-），男，河北魏县人，河北省邯郸市第一医院主治医师，医学硕士，从事肝胆外科疾病诊治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.08.009