活血化瘀补肾壮骨中药促进BMP基因克隆转染犬牙髓细胞增殖的实验研究

刁志虹，高 毅，李 威

（1.河北省石家庄市第一医院口腔科，河北石家庄 050011；2.河北省中医院口腔科，河北石家庄 050017）

活血化瘀补肾壮骨中药促进BMP基因克隆转染犬牙髓细胞增殖的实验研究

刁志虹1，高 毅2*，李 威2

（1.河北省石家庄市第一医院口腔科，河北石家庄 050011；2.河北省中医院口腔科，河北石家庄 050017）

目的观察活血化瘀补肾壮骨含药血清对骨形成蛋白2（bonemorphogenetic proteins 2，BMP2）绿色荧光融合蛋白（green-fluorescent protein，GFP）真核表达质粒（pEGFP-N1-BMP2）在体外转染的犬牙髓细胞（dog dental pulp cells，DDPCs）增殖情况的影响，探讨活血化瘀补肾壮骨中药在牙本质改建形成中的作用机制。方法将BMP2-DDPCs分别于活血化瘀补肾壮骨含药血清组（A组）、无药血清组（B组）和胎牛血清组（C组）中培养。分别于24、48、72h用溴化-3-（4，5-二甲基噻唑基-2）-2，5二苯基四氮唑［3-（4，5-dimethythiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT］法检测BMP2-DDPCs增殖活性。结果BMP2-DDPCs分别在A、B、C 3组中培养后，细胞的形态相同。3组细胞随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增加，A组增加更为显著，与其他2组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论活血化瘀补肾壮骨中药含药血清作用于BMP2-DDPCs，促进了该细胞增殖活性，血化瘀补肾壮骨中药含药血清大大增加了组织工程重要环节的种子细胞的数量。

细胞增殖；活血祛瘀剂；中草药

保存牙髓活力是临床治疗牙体、牙髓疾病的一项基本原则，牙本质的修复在口腔医学领域是一个前沿课题。中医中药在促进新骨形成、骨愈合方面积累了大量经验。组织工程技术的出现为牙本质的修复提供了一种理想的治疗方法，而作为组织工程中重要环节的种子细胞数量的多少是影响牙本质修复效果的重要因素。本实验应用活血化瘀补肾壮骨含药血清作用于骨形成蛋白2（bone morphogenetic proteins 2，BMP2）绿色荧光融合蛋白（greenfluorescent protein，GFP）真核表达质粒（pEGFPN1-BMP2）在体外转染的犬牙髓细胞（dog dental pulp cells，DDPCs）观察中药对BMP2-DDPCs增殖的影响，探讨活血化瘀补肾壮骨中药在牙本质改建形成中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 种子细胞BMP2-DDPCs的培养、转染：见参考文献［1］。

1.2 药剂制备：中药土鳖虫、自然铜、血竭、醋制乳香、续断、杜仲、骨碎补、桑寄生、川芎、杭白芍、炙甘草河北医科大学生化教研室提供。按5.0g生药/kg体质量计算用药量。除血竭以外的药物加10倍量水煎煮1.5h，过滤；加同量蒸馏水重煎1.5h，过滤。合并滤液浓缩至150mL，装袋备用。

1.3 实验分组：实验分为含药血清组（A组）、无药血清组（B组）和胎牛血清组（C组）。A组血清来自2只健康犬，按体表面积的方法折算人体等效剂量，连续7d喂药后，最后1d间隔2h再次给药，于末次给药后1h股动脉采血，离心3 000r/min，20min，取上清，滤菌器（Biotech，0.20μm）抽滤除菌后分装，-20℃保存备用。B组该组血清来自2只健康犬，给予等剂量生理盐水连续7d喂服，最后1d间隔2h再次给予生理盐水，于末次给予生理盐水后1h股动脉采血，离心3 000r/min，20min，取上清，抽滤除菌后分装，-20℃条件下保存备用。C组血清购买于杭州四季青生物工程有限公司。

1.4 BMP2-DDPCs增殖活动检测：采用溴化-3-（4，5-二甲基噻唑基-2）-2，5二苯基四氮唑［3-（4，5-dimethythiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT］法检测活血化瘀补肾壮骨方剂对BMP2-DDPCs生长和增殖情况的影响。将BMP2-DDPCs细胞经胰蛋白酶消化、显微镜下计数后，调整细胞密度为5×108/L，每孔100μL接种于96孔细胞培养板中，37℃，5%CO2培养箱中培养2d，根据实验设计将培养液置换成3种血清继续培养，每组6个复孔，分别培养24、48、72h，各孔中加入5g/LMTT 20μL，继续培养4h，吸出上清，每孔中加入100μL二甲基亚砜摇床振荡15min使结晶充分溶解，用酶联免疫测试仪测定490nm的每孔细胞吸光度（OD值）。

1.5 统计学方法：应用SPSS15.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

BMP2-DDPCs分别在A、B、C 3组中培养后，细胞的形态相同；3组细胞随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增加，A组增加更为显著，与其他2组差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 BMP2-DDPCs分别在A、B、C 3组中培养后细胞增殖情况比较Table 1 Comparison of BMP2-DDPCs proliferation in Chinese tradition medicine serum，non-medicine serum and the bovine serum

3 讨 论

祖国医学认为，肾为先天之本，主骨生髓，骨的生长、发育与肾精盛衰休戚相关。国内学者［2-5］发现补肾中药能促进成骨细胞的增殖和分化。本研究选用补肾壮骨中药，其中骨碎补、续断、桑寄生的作用为滋养肝肾、强筋健骨、促进骨愈合、促进骨基质钙化，另外骨碎补可明显增加成骨细胞活性。土鳖虫、血竭、醋制乳香、白芍、杜仲具有调气活血、散瘀止痛的作用。自然铜性平、味辛，具有散瘀止痛的作用，可明显促进骨愈合。在临床上诸药合用可以达到促进新骨形成的目的。

Yang等［6］证实BMP2具有诱导牙髓细胞分化为成牙本质细胞的能力，进而促进成牙本质的作用。然而外源性BMP2在体内的生物活性低，吸收较快，易降解，不能长久稳定地发挥诱导作用［7］，而基因转染技术能使细胞在相对长的时间内表达需要的目的基因，在局部长期稳定的释放细胞生长因子。

pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒转染后的DDPCs能够表达BMP2基因，BMP2蛋白表达呈阳性，质粒转染促使DDPCs分泌BMP2蛋白，进而参与诱导成牙本质作用［8］。转染BMP2基因可提高DDPCs的碱性磷酸酶活性且明显高于对照组，提示BMP2基因转染促进了DDPCs向成牙本质细胞表型分化［9］。BMP2-DDPCs超微结构与成牙本质细胞超微结构的特征相符，符合成牙本质细胞的表型，而且pEGFP-N1-BMP2转染前后DDPCs增殖情况没有明显的改变［10］。扫描电镜观察异种烧结骨上细胞黏附、生长的情况，可见支架材料的孔径为100～600μm，材料表面粗糙，利于细胞的黏附生长，孔隙中可见BMP2-DDPCs贴附于材料上，生长旺盛，伸展良好［1］。

本实验结果显示，BMP2-DDPCs分别在含药血清、无药血清和牛血清组中培养后，细胞的形态相同；3组细胞随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增加，含药血清组增加更为显著。说明补肾壮骨中药含药血清作用于BMP2-DDPCs，可以促进该细胞增殖，大大增加了组织工程重要环节的种子细胞的数量。本研究为pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒转染的牙髓成纤维细胞经中药增殖后与异种烧结骨复合作为新型有效的盖髓剂应用于临床提供了实验基础。

［1］ 冯艳红，刁志虹，高毅，等.BMP2基因转染犬牙髓成纤维细胞与异种烧结骨复合组织工程的实验研究［J］.河北医科大学学报，2011，32（8）：908-912.

［2］ 邵敏，赵静，王斌.不同中药含药血清对体外培养成骨细胞影响的实验研究［J］.中国中医骨伤科杂志，2006，14（5）：19-21.

［3］ 任贵云，赵虎，董福生，等.活血化瘀补肾壮骨中药促进山羊下颌骨牵张成骨的实验研究［J］.实用口腔医学杂志，2009，25（3）：319-322.

［4］ 董福慧，郑军.骨碎补对骨愈合过程中相关基因表达的影响［J］.中国中西医结合杂志，2003，23（7）：518-521.

［5］ 闫宝勇，董福生，董玉英，等.补肾壮骨中药对成骨细胞OPG、RANKLmRNA表达的影响［J］.现代口腔医学杂志，2011，25（3）：194-198.

［6］ YANG X，VAN DER KRAAN PM，VAN DEN DOLDER J，et al. STRO-1 selected rat dental pulp stem cells tansfected with adenoviral-mediatd humen bone morphogenetic proteins 2 gene show enhanced odontogenic differentiation［J］.Tissue Eng，2007，13（11）：2803-2812.

［7］ FRANCESCHI RT，WANG D，KREBSBACH PH，et al.Gene therapy forbone formation：in vitro and in vivo osteogenic activity of adenovirusexpressing BMPT［J］.J Cell Biochem，2000，78（3）：476-478.

［8］ 冯艳红，刁志虹，高毅，等.BMP2基因转染犬牙髓细胞的实验研究［J］.河北医科大学学报，2011，32（9）：1079-1082.

［9］ 刁志虹，高毅，冯艳红，等.骨形成蛋白2基因转染对犬牙髓细胞生物学特性的影响［J］.河北医药，2011，33（24）：3688-3691.

［10］ 冯艳红，刁志虹，高毅，等.骨形态发生蛋白2基因转染犬牙髓细胞［J］.中国组织工程研究，2012，16（2）：206-210.

（本文编辑：刘斯静）

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《河北医科大学学报》编辑部

THE EXPERIMENTAL STUDY ON THE PROMOTIVE EFFECT OF CHINESE TRADITION MEDICINE ON PROLIFERATION OF DOG DENTAL PULP CELLS TRANSFECTED BY BMP2 GENE

DIAO Zhihong1，GAO Yi2*，LIWei2
（1.Department of Stomatology，the First Hospital of Shijiazhuang City，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China；
2.Department of Stomatology，Hebei Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo observe the effect of Chinese tradition medicine serum on the proliferation of dog dental pulp cells（DDPCs）transfected with pEGFP-N1-BMP2 eukaryotic expression plasmid in vitro.To investigate the mechanism of Chinese tradition medicine on formation of dentin. M ethods BMP2-DDPCs were cultivated respectively in Chinese tradition medicine serum group（group A），non-medicine serum group（group B）and fetal bovine serum group（group C）.The proliferation activity of BMP2-DDPCswas detected respectively by the 3-（4，5-dimethythiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide（MTT）after 24 hours，48 hoursand 72hours.ResultsAfter BMP2-DDPCs were cultivated in three kinds of serum，there were no differences in the cellsmorphology，but there were differences in the number of the cells.With the prolongation of culture time，the number of the cells gradually increased in the 3 groups，among which medicine serum group increased more prominently. There were significant differences between Chinese traditionalmedicine serum group and the other two groups（P＜0.05）.ConclusionThe Chinese tradition medicine could promote proliferation of BMP2-DDPCs and obviously increase the quantity of seed cells in dentin tissue engineering.

cell proliferation；BLOOD ACT STASISREMOV AGENTS；drug，Chinese herbal

R282

A

1007-3205（2012）08-0911-03

2012-02-18；

2012-05-28

河北省科技厅科学技术支撑计划项目（09276102D-15）

刁志虹（1966-），男，山东黄县人，河北省石家庄市第一医院副主任医师，医学学士，从事口腔科疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：DZH666888@yahoo.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.08.015