蛋氨酸对化疗药物引起内耳损伤的保护作用

黄 瑛，马颖钰，张 璞，林 曦，曲 雁*

（1.云南省昆明市第一人民医院耳鼻咽喉科，云南昆明 650000；2.河北医科大学第三医院耳鼻咽喉科，河北石家庄 050051；3.美国Emory大学医学院耳鼻咽喉头颈外科，乔治亚州亚特兰大 30322-3030）

蛋氨酸对化疗药物引起内耳损伤的保护作用

黄 瑛1，马颖钰2，张 璞2，林 曦3，曲 雁2*

（1.云南省昆明市第一人民医院耳鼻咽喉科，云南昆明 650000；2.河北医科大学第三医院耳鼻咽喉科，河北石家庄 050051；3.美国Emory大学医学院耳鼻咽喉头颈外科，乔治亚州亚特兰大 30322-3030）

目的研究蛋氨酸对化疗药物顺铂导致耳毒性的保护作用。方法将30只昆明小鼠随机分为3组。顺铂组（n=10）：给予顺铂3.5mg·kg-1·d-1腹腔注射，连续7d；蛋氨酸+顺铂组（n=10）：蛋氨酸300mg·kg-1· d-1腹腔注射，30min后给予顺铂3.5mg·kg-1·d-1腹腔注射，连续7d；对照组（n=10）：生理盐水3.5mg·kg-1· d-1腹腔注射，连续7d。实验第8天，利用听觉脑干诱发电位（auditory brainstem response，ABR）对3组小鼠进行听功能测试，然后迅速断头取出双侧内耳，解剖耳蜗基底膜，铺片并HE染色，普通光学显微镜下观察。结果在ABR测试中，对照组小鼠实验前后听力无明显变化；顺铂组小鼠听阈及Ⅰ波和Ⅲ波潜伏期与对照组相比变化明显；蛋氨酸+顺铂组小鼠听阈及Ⅰ波和Ⅲ波潜伏期与对照组相比也出现变化，但变化程度较顺铂组明显减轻。光镜观察：对照组动物耳蜗基底膜外毛细胞排列整齐；顺铂组基底膜外毛细胞有不同程度的坏死、脱落，尤以底转缺失严重；蛋氨酸+顺铂组耳蜗毛细胞损伤较顺铂组明显减轻。结论化疗药物顺铂对耳蜗毛细胞引起损害，而蛋氨酸对这种损害有较好的保护作用。

内耳；S-腺苷甲硫氨酸；顺铂

1 材料与方法

1.1 实验动物：选取30只昆明小鼠，体质量15～30g，耳廓反应灵敏，雌雄均有，小鼠专用鼠粮喂养。将其随机分为3组，每组10只（n=10）。顺铂组，给予顺铂3.5mg·kg-1·d-1腹腔注射，连续7d；蛋氨酸+顺铂组，首先蛋氨酸300mg·kg-1·d-1腹腔注射，30min后给予顺铂3.5mg·kg-1·d-1腹腔注射，连续7d；对照组，生理盐水3.5mg·kg-1·d-1腹腔注射，连续7d。

1.2 脑干诱发电位（auditory brainstem response，ABR）的检测：小鼠在腹腔注射水合氯醛（400mg/ kg）麻醉后，采用美国Nico-let公司questTM型诱发电位检测仪对用药后的小鼠听功能进行测试。以波Ⅲ阈值作为判断ABR阈值的标准［2］，并测量100dB peSPL时的Ⅰ波和Ⅲ波的潜伏期。

1.3 光镜标本制作及观察：测试ABR后，在小鼠麻醉状态下立即断头并取出双侧听泡，在解剖显微镜下解剖耳蜗，蜗尖钻孔，从蜗尖灌注10%福尔马林溶液并在4℃下在此溶液当中固定24h。固定的耳蜗经0.1mol/L的PBS液冲洗后用10%乙二胺四乙酸二钠脱钙1周，每天更换脱钙液1次，而后经0.1mol/L的PBS液洗涤3次后，在解剖显微镜下进行耳蜗基底膜的剥离，将基底膜进行分回截断铺片并HE染色，普通光学显微镜（放大400倍）下观察［3］。

1.4 统计学方法：应用SASV8.0统计软件进行数据处理，计量资料以±s表示，分别采用F检验和q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ABR反应阈和ABR的Ⅰ波和Ⅲ波潜伏期：3组小鼠之间听力出现明显变化，顺铂组小鼠Ⅲ波阈值明显增加且Ⅰ波和Ⅲ波潜伏期明显延长，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。蛋氨酸+顺铂组小鼠Ⅲ波阈值及Ⅰ波和Ⅲ波潜伏期也出现增加和延长，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且与顺铂组小鼠比较差异也有统计学意义（P＜0.05），即蛋氨酸+顺铂组小鼠听力的变化较顺铂组小鼠的变化小。见表1。

表1 顺铂组、蛋氨酸+顺铂组和对照组ABR水平比较Table 1 The result of ABR of cisp latin group，methionine group and control group

2.2 光镜观察：对照组小鼠耳蜗基底膜外毛细胞排列整齐，结构清晰，无变性、损坏。顺铂组小鼠基底膜外毛细胞有不同程度的坏死、脱落，尤以底转缺失严重。蛋氨酸+顺铂组小鼠耳蜗毛细胞较顺铂组小鼠耳蜗毛细胞损伤明显减轻，尤以底转和中转的保护作用明显。见图1～3。

图1 耳蜗基底膜底转毛细胞情况（HE×400） A.对照组底转，外毛细胞排列整齐、结构清晰；B.蛋氨酸+顺铂组底转，外毛细胞有间断的缺失；C.顺铂组底转，外毛细胞缺失严重Figure1 Thehaircellsofbaselturninthecocheal（HE×400） A.Onbasalturn，outercellsofcontrolgroupshowinglinedupregularlyandclear；B.Onbasalturn，outer cellsofD-metgrouplosinginterruptablely；C.Onbasalturn，outercellsofcisplatingroup losingextensively图2 耳蜗基底膜中转毛细胞情况（HE×400） A.对照组中转，外毛细胞排列整齐、结构清晰；B.蛋氨酸+顺铂组中转，外毛细胞有间断的缺失；C.顺铂组中转，外毛细胞缺失严重Figure2 Thehaircellsofmiddleturninthecocheal（HE×400） A.Onmiddleturn，outercellsofcontrolgrouparelinedupregularly；B.Onmiddle turn，outercellsofD-metgrouplosinginterruptablely；C.Onmiddleturn，outercellsofcisplatingrouplosingextensively图3 耳蜗基底膜顶转毛细胞情况（HE×400） A.对照组顶转，外毛细胞排列整齐、结构清晰；B.蛋氨酸+顺铂组顶转，外毛细胞有间断的缺失；C.顺铂组顶转，外毛细胞缺失严重Figure3 Thehaircellsofapicalturninthecocheal（HE×400） A.Onapicalturn，outercellsofcontrolgroupshowinglinedupregularly；B.Onapical turn，outercellsofD-metgrouplosinginterruptablely；C.Onapicalturn，outercellsofcisplatingrouplosingextensively

3 讨 论

顺铂引起的耳毒性在临床上表现为耳鸣、耳聋，听力损失的特点呈进行性、不可逆性和双侧性并伴随听觉器官的永久性损害。顺铂处理过的动物听力脑干反应阈值增加，特别是高频。有研究［3］表明，顺铂引起的动物毛细胞损害总是首先从耳蜗底回开始并逐渐向顶回发展，因此听力功能障碍往往首先表现为高频听力的损失。这与本研究观察到的结果是一致的，而随着毛细胞损害范围的扩大，低频听力也随之发生障碍。

顺铂引起的毒性机制目前有多种假说，其中自由基引起的氧化应激是顺铂引起耳毒性的重要机制之一［4］。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一类性质活泼的自由基，其攻击的靶点是膜脂的多不饱和脂肪酸，从而使细胞膜的结构和功能发生改变。有研究［5］表明，在耳蜗分离组织中应用顺铂会产生大量ROS，使耳蜗内的抗氧化剂谷胱甘肽及抗氧化酶减少，还会引起脂质过氧化，脂质过氧化可使细胞钙离子内流，细胞的凋亡增加。可见，应用顺铂后打破了细胞内自由基的平衡，大量产生的ROS通过一系列的反应导致毛细胞的死亡，最终引起听力的损失。但是在机体内，自由基的产生与清除处于动态平衡当中，抗氧化剂能消除自由基，维持正常的细胞结构和功能。耳蜗的内源性防护分子包括谷胱甘肽、抗氧化物酶、热休克蛋白、腺苷受体以及血红素加氧酶等［6］，虽然这些分子在应用顺铂后会有一定的表达上调，但是顺铂的大剂量应用所引起的氧化应激可以压倒这些内在的防御机制，从而不能完全克服顺铂的毒性作用。

抗氧化剂作为外源性保护分子可以拮抗ROS引起的损伤。蛋氨酸作为一种巯基抗氧化剂具有多种保护作用但最主要的是直接或间接的抗氧化剂，大多数巯基化合物都是亲电子的，可以清除自由基。Vogt等［7］研究证明蛋氨酸可以使氧化可逆，充当了一种自由基清除剂。蛋氨酸表现出多样的抗氧化作用是通过对主要酶类的保护而实现的。蛋氨酸可以明显防止顺铂引起的耳蜗超氧化物歧化酶、过氧化氢酶以及谷胱甘肽还原酶的水平的降低，防止谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛水平的上升［8］。大量的蛋氨酸可以阻止谷胱甘肽从细胞内流出从而保护细胞免受损伤。在预防耳毒性上，蛋氨酸可以对噪声及氨基糖甙类抗生素引起的听力损失起保护作用，蛋氨酸对庆大霉素导致的听力损伤的防治作用是通过抑制产生的ROS和一氧化氮实现保护耳蜗的感觉细胞的，鉴于药物耳毒性有着相类似的发病机制，本研究将蛋氨酸用于顺铂耳毒性的预防上，在形态上蛋氨酸在底转、中转和顶转对顺铂引起的毛细胞损害有着很好的保护作用；在功能上，通过听性脑干反应的检测可以发现，蛋氨酸可以使ABR阈值降低。ABR波Ⅰ来自耳蜗（常受耳蜗基底回病变特征的影响），波Ⅱ来自耳蜗核，波Ⅲ来自上橄榄核，波Ⅳ来自外侧丘系，波Ⅴ来自下丘。药物性耳毒性引起的听力损伤部位常涉及到耳蜗基底回。顺铂+蛋氨酸组测量的Ⅰ波的潜伏期缩短，很好地证明了蛋氨酸在耳蜗基底回对顺铂引起的听力损失具有保护作用。

总之，巯基化合物蛋氨酸可以在形态和功能上对顺铂造成的耳蜗损害有一定的保护作用。另外，有报道称蛋氨酸在防御耳蜗毒性的同时却不影响抗肿瘤药的效果［9］，且口服与腹腔注射相同量的蛋氨酸在ABR的功能测定上有等同的作用［10］。因此，我们认为蛋氨酸将有望成为一类有前途的防御耳毒性的药物，为广大顺铂应用者提供了保护听力的极大可能。

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（本文编辑：赵丽洁）

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THE PROTECTIVE EFFECT OF METH IONINE AGAINST COCHLEAR DAM AGE INDUCED BY CHEMOTHERAPEUTICS

HUANG Ying1，MA Yingyu2，ZHANG Pu2，LIN Xi3，QU Yan2*
（1.Department of Otorhinolaryngology，the First Hospital of Kunming City，Yunnan Province，Kunming 650000，China；2.Department of Otorhinolaryngology，the Third Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050051，China；
3.Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，School of Medicine，Emory University，Atlanta，GA 30322-3030，USA）

ObjectiveTo evaluate the protective effect of methionine against the ototoxicity induced by cisplatin.MethodsThirty Kunming mice were divided into three groups.Themice of group one intraperitoneallywere injected with cisplatin（3.5mg·kg-1·d-1）alone；themice of group two were injected methionine（300mg·kg-1·d-1）30 min before receiving cisplatin；and themice of group three received saline injection only in equal volume to the cisplatin group.All of the injection were given once daily for 7 consecutive days.Auditory brainstem response（ABR）audiometry was used to evaluate the hearing level.Then，themicewere sacrificed and acoustic capsulewere removed.The basalmembranewas obtained，and stained with HE.It was observed under the lightmicroscope.ResultsAuditory threshold shifts：there was no obvious change after the experiment in the control group，the ABR thresholds and the peak latency of waveⅠand waveⅢwere changed dramatically in injected cisplatin alone group compared with the control group，and the change was also appeared in injected methionine group，but itwas not so great.Morphology，outer hair cells from basilarmembrane in the control group were lined up regularly.Extensive loss of outer hair cells could be seen in basal turns of cochlear treated with cisplatin. Moderate hair cell losswas seen in themiddle turns of these ears.In contrast，basilarmembrane waswell preserved in all turns of the cochlea in themethionine group，especially in basal turn and in middle turn.ConclusionCisplatin can induce ototoxicity to the organ of Corti，and the protective effect ofmethionine against this ototoxicity can be seen in both function and morphology.

ear，inner；s-adenosylmethionine；cisplatin顺铂是一种临床中常用的化疗药物，其对睾丸精原细胞瘤、卵巢肿瘤晚期等生殖系统肿瘤的治疗以及肿瘤的联合化疗具有无可替代的优势，但是顺铂引起的耳毒性、肾毒性及神经毒性等不良反应阻碍了其在临床中的应用。顺铂引起的毒性机制目前还不十分清楚，但有研究发现顺铂可以损伤耳蜗的螺旋器和螺旋神经节细胞［1］。如何对抗顺铂应用过程中的耳毒性损伤，一直是人们研究的热点。蛋氨酸又名甲硫氨酸，其不但是一种必需氨基酸参与蛋白质的合成，还可利用所带的甲基对有毒物或药物进行甲基化而起到解毒的作用，另外，蛋氨酸可以充当含硫抗氧化剂。本研究通过动物实验，从形态和功能上探讨蛋氨酸对顺铂导致的耳毒性损伤的对抗作用。

R764.83

A

1007-3205（2012）08-0904-04

2012-01-26；

2012-04-24

河北省自然科学基金资助项目（C2010000586）

黄瑛（1963-），女，湖南长沙人，云南省昆明市第一人民医院耳鼻咽喉科副主任医师，从事耳鼻咽喉科疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：quyan_2003@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.08.013