不同浓度过氧化脲对牙龈上皮细胞生长影响的实验研究

郭红延　王晓玲　朱晓英　伊元夫

[摘要]目的：评价不同浓度过氧化脲对体外培养的人牙龈上皮细胞生长的影响，获得不同浓度过氧化脲引起人牙龈上皮细胞凋亡的时间范围。方法：体外培养人牙龈上皮细胞并进行鉴定，采用含10%及20%过氧化脲的EpiLife上皮细胞专用无血清培养基进行培养，选取不同时间段计算细胞死亡率。结果：体外培养的人牙龈上皮细胞为多边形并呈铺路石状外观，角蛋白染色阳性，含10%过氧化脲培养基进行培养90s后细胞大量死亡，含20%过氧化脲培养基进行培养60s后细胞大量死亡。结论：过氧化脲对体外培养的人牙龈上皮细胞具有较强的细胞毒性，临床常用过氧化脲污染牙龈时间不能超过1min。

[关键词]过氧化脲；牙龈上皮细胞；细胞凋亡

[中图分类号]R783.1Q813.1 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）08-1337-03

随着人们对美的不断追求，牙齿美容越来越被人们所重视，牙齿漂白是牙齿美容的一部分，它是根据氧化置换的原理，将牙齿内的色素置换出来，以达到牙齿美白的目的。过氧化脲是常用的牙齿漂白剂之一，随着临床牙齿漂白应用的增多以及家庭漂白的普及，过氧化脲的安全性越来越受到重视[1-2]。

在牙齿漂白的临床操作过程中，与牙齿位置最近的牙龈是最容易受到氧化剂损伤的组织[3]，本研究以体外培养的人牙龈上皮细胞为研究对象，研究不同作用时间下过氧化脲对人牙龈上皮细胞的损伤，为临床过氧化脲的安全应用提供理论依据。

1材料和方法

1.1 材料：DMEM培养基（Sigma 美国）；胎牛血清（FCS Gibco，美国）；EpiLife角化上皮细胞专用培养基（Cascade Biologics，USA）；胰蛋白酶（Sigma 美国）；兔抗人角蛋白多克隆抗体（MAXIM-BIOTECH，美国）；鼠抗兔IgG（MAXIM-BIOTECH，美国）；SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 选取临床冠延长术患者，签署知情同意书，切取健康牙龈组织，置入含15%胎牛血清的DMEM培养基中。实验室中修剪所获得的牙龈组织，剪除纤维结缔组织，用含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的D-Hank's液反复清洗，浸泡20min，然后剪成约0.5mm3的组织块，均匀铺于培养瓶底，5%CO2培养箱中倒置2h，然后加入15%胎牛血清的DMEM培养基进行常规细胞培养，3天后观察有上皮细胞自组织块边缘爬出并生长，继续培养7天后换用EpiLife上皮细胞专用无血清培养基进行培养，每2天更换培养基，待细胞生长至约瓶底的70%～80%时进行传代继续培养。

1.2.2 细胞爬片、鉴定：在培养皿中置入消毒的盖玻片，将传代培养的细胞消化后接种于消毒的盖玻片表面，静置24h后加入培养液，放入二氧化碳培养箱中培养。在培养后第10天，取出生长有上皮细胞的盖玻片，PBS液冲洗干燥制备原代培养的细胞爬片。角蛋白抗体染色采用即用型SABC免疫组化染色试剂盒（博士德公司），一抗为1∶500兔抗人角蛋白多克隆抗体，二抗为生物素标记的鼠抗兔IgG，第2层为酶标生物素-卵白素复合物，DAB显色，中性树胶封片。PBS作空白对照，同时设立成纤维细胞组为阴性对照组。

2结果

2.1 细胞培养及鉴定结果：组织块贴壁后，第三天开始有上皮细胞从组织块边缘爬出，并以组织块为中心向四周生长，细胞呈多边形，紧密排列，呈铺路石状外观。细胞核大而圆或者卵圆形，有多个核仁，胞浆丰满，细胞分布均匀，大小一致。培养至7～10天时改用EpiLife上皮细胞专用无血清培养基进行培养后，细胞形态没有明显改变，但细胞体积有所减小，排列稍松散。待到细胞进行传代培养后，细胞贴壁后分布均匀，形态以多边形为主出现多样化。细胞来源鉴定：细胞免疫组化染色显示胞浆内呈棕黄丝网状，表明角蛋白阳性。

3讨论

过氧化脲（carbamide peroxide，CP）又称过碳酰胺、过氧化氢尿素、过氧化碳酰胺，是尿素和过氧化氢所形成的加合物，兼有尿素和过氧化氢的特性，尿素的氨基既能中和过氧化氢的酸性，又克服了过氧化氢难以储存和运输的缺点。过氧化脲理论活性氧含量为17.0%，同其它的几种过氧化物相比，过氧化脲具有活性氧值高，水溶液pH值低，稳定性好，溶解度大，释氧速度慢，作用时间长，用后无残余毒性，对皮肤刺激性、破坏性小等优点，因此，临床上过氧化脲是最常用的漂白剂之一[4]。早在20世纪60年代末，有国外学者就将10%的过氧化脲放置于为患者专门制作的托盘中，这样患者就可以在家中自行漂白。20世纪90年代初，有学者报道了活髓牙夜间漂白技术，因其安全、有效、方便而深受医患双方的青睐[5]。

一般来讲1%～10%的CP用于家庭漂白，30%～35%的CP常用于诊室漂白。10%CP是常用家庭漂白剂，因其安全性和有效性，现已被美国牙医协会（American Dental Association， ADA）接受[6]。目前，家庭漂白剂使用的浓度有增高趋势，15%～35%的CP已出现在家庭漂白剂市场上。有制造商和临床医生宣称浓度高于10%的CP可以获得更满意的临床漂白效果[7]。

然而，过氧化脲作为一种强氧化剂，其细胞刺激性也深为临床医生们所担忧，浓度越高，其针对组织与细胞所产生的刺激性作用就越大，有学者研究了相关过氧化氢及过氧化脲针对成纤维细胞以及牙龈成纤维细胞的毒性作用[8]，但作为临床漂白剂的使用，其最主要的接触对象是牙龈上皮组织，也就是说，牙龈上皮细胞对过氧化脲的毒性反应应该是医生及使用者最为关心的。牙龈上皮细胞的培养不论从取材到原代培养，都比较困难，在取材方面，由于正常牙龈组织需要临床切除的患者较少，只能从冠延长术以及种植手术过程中获得，因此临床取材需要有一定的限制。在细胞培养方法上，牙龈上皮细胞的培养一般有组织块法及酶消化法两种方法，传统的组织块培养法一般采用含血清的低糖或者高糖DMEM培养基，血清具有营养、促进细胞和组织贴附、促进生长的作用，在组织块法细胞培养的初期可以增加组织块的贴壁率以及细胞从组织块边缘的爬出。而酶消化法成功培养牙龈上皮细胞较为困难。本研究采用组织块培养法进行原代人牙龈上皮细胞培养，然后更换EpiLife上皮细胞专用无血清培养基继续培养，最后获得分化良好，数量足够的牙龈上皮细胞。

细胞培养方法是一种非常敏感的细胞毒性试验法，有学者采用体外培养的细胞系检测口腔应用药物的细胞毒性[9]，但该方法有一定的局限性，一般只能提供有关物种细胞对材料反应的信息，由于体外培养和体内环境的差别，这种方法不能提供体内有关组织对材料如何反应的信息。本研究采用临床常用10%和20%过氧化脲浓度配制EpiLife上皮细胞专用无血清培养基，对体外培养的人牙龈上皮细胞进行处理，结果发现含10%浓度过氧化脲的培养基处理90s后，细胞开始大量死亡，而含20%浓度过氧化脲的培养基处理60s后，细胞开始大量死亡。结果表明，临床常用浓度的过氧化脲对牙龈上皮细胞具有较强的细胞毒性，随着接触时间的延长，其对细胞的破坏作用也越大。体外培养的人牙龈上皮细胞因为其培养环境以及细胞间相互连接都和体内有很大区别，这就使得体外培养的牙龈上皮细胞较为脆弱，本研究所获得的实验数据只是针对体外培养的人牙龈上皮细胞，含同样浓度的过氧化脲美白产品对口内牙龈上皮产生损害的时间应该相应的长一些。

[参考文献]

[1]Alonso de la， Pena V， Balboa Cabrita O. Comparison of the clinical efficacy and safety of carbamide peroxide and hydrogen peroxide in at-home bleaching gels[J].Quintessence Int，2006，37（7）：551-556.

[2]Demarco FF， Meireles SS， Masotti AS. Over-the-counter whitening agents： a concise review[J].Braz Oral Res，2009，23 Suppl 1：64-70.

[3]Lazarchik DA， Haywood VB.Use of tray-applied 10 percent carbamide peroxide gels for improving oral health in patients with special-care needs[J].J Am Dent Assoc，2010，141（6）：639-646.

[4]Strassler HE， Scherer W， Calamia JR. Carbamide peroxide at-home bleaching agents. An update[J].NY State Dent J，1992，58（4）：30-35.

[5]王晓玲，赵信义，何惠明，等.过氧化脲漂白剂的配置与标定[J].中国美容医学，2007，16（5）：680-682.

[6]Lazarchik DA， Haywood VB. Use of tray-applied 10 percent carbamide peroxide gels for improving oral health in patients with special-care needs[J].J Am Dent Assoc，2010，141（6）：639-646.

[7]王晓玲，郭红延，马妍，等.过氧化脲漂白剂的临床效果评价[J].中国美容医学，2009，18（8）：1148-1152.

[8]Soares DG，Ribeiro AP，Sacono NT，et al. Transenamel and transdentinal cytotoxicity of carbamide peroxide bleaching gels on odontoblast-like MDPC-23 cells[J].Int Endod J，2011，44（2）：116-125.

[9]Babich H，Wurzburger BJ，Rubin YL，et al. An in vitro study on the cytotoxicity of chlorhexidine digluconate to human gingival cells[J].Cell Biol Toxicol，1995，11（2）：79-88.

[收稿日期]2012-02-26[修回日期]2012-04-12

编辑/张惠娟