宽口裂腹鱼不同组织总RNA提取与质量分析

魏杰 张玲 马振华 聂竹兰 高泽霞

摘?要：本文采取宝生物公司RNAiso plus试剂从宽口裂腹鱼肌肉、脑、肾脏、肝脏、肠、性腺、心脏中提取总RNA，分析了所提宽口裂腹鱼不同组织总RNA的质量高低，及造成质量不同的具体原因，旨在为其他科研工作者在分析RNA质量时提供基础理论依据。

关键词：宽口裂腹鱼?组织?总RNA

中图分类号：Q52 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2012）10（a）-0019-03

宽口裂腹鱼（Schizothorax eurystomus

（Kessler））属鲤科、裂腹鱼亚科、裂腹鱼属[1]，分布于新疆塔里木河水系阿克苏河（库马力克河、托什干河、阿克苏河）、渭干河（木扎提河、克孜尔河、渭干河、克孜尔水库、东方红水库）、叶尔羌河（塔什库尔干河、叶尔羌河、提孜那普河），是塔里木河水系的土著鱼类[2]。随着新疆水产业的发展，塔里木河土著鱼类的研究项目呈上升趋势，尤其在土著鱼类基础生物学方面，研究较多[3-5]。但对于土著鱼类分子生物学方面，仅见于扁吻鱼、塔里木裂腹鱼及斑重唇鱼线粒体DNA部分序列片段与基础遗传多样性方面的研究[6-7]。而对于塔里木河土著鱼类中宽口裂腹鱼的分子生物学方面尚未见报道。

本实验主要探讨了宽口裂腹鱼不同组织总RNA提取与质量，分析了不同组织所提RNA质量高低及其出现差异的原因。RNA分离提取是分子生物学研究的基本内容，也是功能基因组学研究技术的重要基础。因此，宽口裂腹鱼不同组织总RNA提取和纯化的研究对于宽口裂腹鱼cDNA文库的构建，Northern杂交分析，定量PCR以及利用mRNA差异显示技术筛选感兴趣的相关基因等提供科技支撑。

1材料与方法

1.1材料

宽口裂腹鱼由拜城县渔民采用三层拉网于黑英山段黑孜尔河捕获。平均体长17.8cm，暂养在玻璃缸内。

1.2玻璃器皿及塑料制品的处理

一次性塑料制品均在0.1%的DEPC水中

浸泡过夜，之后高压蒸汽灭菌（121℃30min）。普通玻璃和金属器皿于180℃干烤8h以上。用于RNA电泳的电泳槽先用去污剂洗干净，双蒸水冲洗，自然干燥后，用灭菌的0.1% DEPC浸泡24h。

1.3试剂

DEPC（焦碳酸二乙酯）、RNAiso Plus（宝生物公司（大连））、6×Loading buffer、氯仿、异丙醇、无水乙醇、EDTA（乙二胺四乙酸）、Tris（三羟甲基氨基甲烷）碱、冰醋酸。

1.4方法

准备工作：DEPC水（DEPC：ddH2O = 1：10000）浸泡所要使用的枪头和EP管（1.5ml）过夜，然后经高压灭菌后回收灭过菌的DEPC水①以制备1×TAE缓冲液；同时预留部分未浸泡过枪头和EP管且稀释过的DEPC水②，同样灭菌后于-20℃保存以备溶解RNA。

（1）活体取样，取0.1g左右宽口裂腹鱼肌肉、脑、肾脏、肝脏、肠、性腺、心脏放入加有1ml的RNAiso Plus（宝生物公司（大连））的EP管，待所取样本全部完成后再进行匀浆，整个实验操作在冰浴上进行，以免RNA降解。

（2）将（1）中组织倒入已灭菌的5mL组织匀浆器中，同时加入0.6～1.0mL的RNAiso Plus和0.4～0.6mL的DEPC水，然后在冰上匀浆至无颗粒或明显组织块。

（3）将上述匀浆液装入新的1.5mL EP管中（一般可装两管），冰上静止5min左右，然后≥12000rpm，4℃离心5min。

（4）取上清液于新的1.5mL EP管中，每管取0.5mL即可，然后加入1/5 RNAiso Plus体积的氯仿，即0.4mL，加入氯仿后需立即用手剧烈振荡15s以混匀。

（5）充分混匀后（无分相现象），≥12000rpm，4℃离心15min，即会分层：上层清液，中层为白色蛋白质，下层为带鲜红色的有机相。

（6）取0.6mL上清液于新的1.5mLEP管中，并加入等体积的异丙醇，然后充分混匀，冰上静止10min，≥12000rpm，4℃离心10min。

（7）弃上清液，此时可见管底有白色沉淀，切勿将其倾倒，而后沿壁缓慢加入1.0mL经冷处理过75%乙醇（RNase-free），清洗沉淀，≥12000rpm，4℃离心5min。

（8）小心弃去乙醇，尽量除尽乙醇，然后室温干燥5min左右，切莫离心或者加热；加入20～50μl的RNase-free water（即DEPC水，上标为②）溶解，待完全溶解后-80℃保存。

（9）总RNA的浓度及纯度测定

核酸蛋白测定仪：测定RNA溶液的吸光值，比较A260/A280的值，保证其在1.8～2.2为比较合适的值；同时测定其浓度（取1ul样品于50μL灭菌的0.1%DEPC水中，再用biophotometer蛋白核酸测定仪测定A260及A280值。RNA纯度按A260/A280之比值判断；RNA浓度=样品浓度×50μL）。

（10）琼脂糖电泳检测

所用琼脂糖凝胶及电解液均用DEPC处理过的水配制（上标为①），电泳检核糖体RNA的28s、18s和5.8s。

2结果与分析

2.1样品的浓度与纯度

经核酸蛋白测定仪测定：肝脏，心脏，肌肉2，肌肉的A260/A280值在1.8～2.2；肝脏、脑和肠的样品浓度均较高，但是脑和肠A260/A280值小于1.8；心脏2和肾脏2的样品浓度较低，A260/A280值亦小于1.8，具体见表1。

核酸蛋白测定仪260nm的读数用于测定DNA或RNA的浓度，280nm的读数用于测定DNA或RNA的纯度[8-9]，由表1结果可知：

（1）肝脏，心脏，肌肉2，肌肉的样品较纯。

4个样品以肝脏的浓度最高，可用后续的分子生物学实验。肌肉2、肌肉与心脏的样品浓度较低，出现这种结果的原因在于，肌肉组织相对于肝脏要坚韧，本次实验匀浆时没有充分研磨；若研磨时间过长RNA会降解，研磨时间不足，RNA提取量少。而心脏组织大小与鱼体大小有关，鱼体偏小，心脏亦小，在匀浆过程中，对于静脉窦及动脉球部分难于磨碎，所以样品浓度偏低。

（2）脑、肠的样品浓度较高；心脏2和肾脏2的样品浓度较低。

它们的A260/A280值均小于1.8，表示存在蛋白质的污染，这是由于实验过程中用枪头吸取水相的过程中，用力过大，将中间的蛋白层吸入，使蛋白质混入RNA提取液中。脑和肠需进一步纯化才能用于后续分子生物学实验。

2.2样品总RNA1%琼脂糖凝胶电泳

从泳道中的亮带可以看出，本次电泳时间（20min）过长，其中的28s和18s有亮带处rRNA的比率不是2：1[10]。泳道1（肌肉）、4（肝脏）、5（脑）、7（肠）、8（脑2）、9（肌肉2）和 10（心脏2）均可见三条清晰亮带28S、18S和5S，但其中的28srRNA处的亮带不是最亮，说明有部分RNA降解；在泳道4、5、8中5s处最亮，说明降解的较多。

泳道2（肾脏）则无亮带，说明肾脏的RNA完全被降解，造成这种后果的原因有多种：①取样时间过长，或者样品保存不当，导致细胞组织坏死；②匀浆时间过长，空气中的RNase进入匀浆管中，RNA降解；③匀浆不够彻底，细胞未破碎，RNA无法从细胞中游离出来；④在加入氯仿后，未及时振荡EP管中的样品，使得DNA，RNA，蛋白质无法分开；具体原因有待进一步研究。

泳道3（性腺）在5s处有亮带，而且很宽，18s和28s则完全看不见，说明这个电泳RNA完全降解了，全部降解成5S大小的片段，严重降解的片段往往是和5s大小近似。因此在跑电泳的时候，就会在5s处重叠。但是这个降解是提取操作不当而降解还是电泳过程中降解的，还需进一步探究。

泳道6（心脏）没有出现28s，28srRNA降解为18srRNA。泳道11（肾脏2）在28s和18s处有亮带，没有出现5s，可能有DNA污染，或者是异丙醇没有混合均匀导致，不会影响后续实验。具体见图1。

综上分析：宽口裂腹鱼不同组织RNA提取后经核酸蛋白测定仪检测知：肝脏、心脏、肌肉和肌肉2，A260/A280在范围1.8～2.0之间，说明样品提取的比较纯；但样品脑，肠，心脏2和肾脏2的A260/A280均在1.8以下，表示受到蛋白质污染，需要纯化样品；心脏、肌肉和肌肉2的样品浓度均较低，但是它们的A260/A280却在1.8～2.0之间，说明样品未受污染，只是某些组织中本来RNA含量就少，或研磨时间不足。经1%琼脂糖凝胶电泳检测知：肌肉、肝脏、脑、肠、脑2、肌肉2、心脏2都可以看见明显的亮带，说明样品比较纯，可以用于后续实验；而肾脏和性腺的RNA完全降解则不能用于后续实验。

综合核酸蛋白测定仪与1%琼脂糖检测结果，本次采用RNAiso Plus试剂，在肝脏中所提取的总RNA质量高，效果好，可以用于进一步的cDNA文库的构建，目的基因的克隆与表达，Northern杂交分析以及利用mRNA差异显示技术筛选。

3结语

目前，RNA提取方法有多种，Chirgwin[11]等采用异硫氰酸胍/氯化铯法成功获得收率和品质均较高的RNA，但该方法操作繁琐。Feramisco[12]等介绍了硫氰酸胍/热酚法获得高质量RNA。Logemann[13]等采用氯化胍法分离了植物组织中的RNA。Cathala[14]采用氯化锂/异硫氰酸胍法获得了既有活性又较完整的RNA。谢保胜[10]、吴旭东[15]等采用异硫氰酸胍法提取了可用于后续实验的斑马鱼和黄河鲶的总RNA，这两个实验在Chomczynski[16]等提出的一步法基础上进行了优化，该方法该法与（异）硫氰酸胍/氯化铯法超速离心法相比，具有简便、经济和高效的特点，能同时迅速地处理多个标本，且RNA的完整性与纯度均很高；但该法不适合从富含甘油三酯的脂肪组织中提取RNA，而且有时RNA会带有多糖和蛋白多糖的污染，这些污染将影响乙醇沉淀后RNA的溶解，同时抑制RT-PCR反应，并通过结合到膜上而影响RNA杂交中的印迹步骤。

本课题组则采用大连宝生物公司的RNAiso Plus试剂对宽口裂腹鱼不同组织总RNA提取量及其质量进行了初步分析。RNAiso Plus试剂采用剧烈的蛋白变性剂，能够抑制RNA酶活性，还能有效地解离核蛋白与核酸的复合体，是获得高纯度RNA比较理想的方法[17]，但是在提取宽口裂腹鱼总RNA时，质量并不高，主要原因在于：

（1）没有RNA专用操作区，公共实验室内实验人员较多，来回走动，影响RNA提取质量。

（2）本次RNA提取时间是在夏季，天气炎热，实验室内没有空调极易受汗液污染。

（3）在匀浆器中加入RNAiso Plus试剂后，研磨时间短，细胞未破裂，导致心脏、肌肉和肌肉2等组织所提RNA量不足。

（4）加氯仿剧烈震荡分层后，操作者在用移液器移取上清液时用力过大，吸入了中间有机相的蛋白质层，使脑，肠，心脏2和肾脏2等组织所提RNA受到蛋白质污染。

（5）电泳时间一般用8min，本次电泳时间过长（20min），造成RNA降解，使其中的28srRNA电泳条带不呈最亮，28s和18s有亮带处rRNA的比率亦不是2：1。

通过实验，得出以下6点建议。

（1）要有RNA专用操作区，应保持清洁，并定期除菌；离心机、自动移液器、试剂等应专用。

（2）用于RNA实验的玻璃器皿清洁后于180℃干热灭菌8h；塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡过夜，经高压蒸汽灭菌后于80℃烘箱中干燥。

（3）实验过程中应戴一次性口罩和橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及汗液中的RNase污染实验器材。

（4）实验人员避免说话或来回走动，以免唾液与空气中的RNase污染。

（5）配制溶液用的酒精、异丙醇等均采用未开封的新瓶，溶液需用灭菌的DEPC水配制。

（6）DEPC（焦碳酸二乙酯）在提取RNA的过程中，可用来抑制RNase的活性。

参考文献

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