凋亡相关蛋白FLIP和NF－κB在人骨肉瘤中表达及其与凋亡的关系研究

付文娟，赵济华，甘洪全，翟宏芳，李琪佳

凋亡抑制蛋白FLIP是新近发现的与恶性肿瘤的发生及转移侵袭密切相关的因子。其全称是Fas相关死亡域样白介素－1β转换酶抑制蛋白 (fas－associated death domain like IL－1 beta converting enzyme inhibitory protein，FLIP)。当肿瘤细胞中FLIP蛋白过表达时，其凋亡过程受到抑制，肿瘤细胞在体内过度堆积，而导致恶性肿瘤的发生。因而FLIP与肿瘤细胞生长密切相关，其作用不可忽视［1］。NF－κB(nuclear factorkappa B)是一类广泛存在于多种组织细胞中，具有多向转录调节作用的核蛋白因子。属于Rel家族成员，能将高等真核细胞外信号传导至核内从而引起基因特殊位点表达。NF－κB过度激活与许多病理现象有关。其中在细胞增殖与凋亡中具有核心作用。除能抑制肿瘤细胞凋亡外，还可具有促进细胞凋亡作用，因此是一种双向调节因子［2］。

上述两种因子在骨肉瘤组织中的表达及相互关系的相关研究报导尚不多见。本研究采用免疫组织化学方法来检测FLIP、NF－κB蛋白在骨肉瘤中的表达，并采用TUNEL法检测骨肉瘤中细胞凋亡程度，探讨二者在骨肉瘤细胞增殖活性与凋亡中的相互关系，为骨肉瘤的基因治疗奠定实验基础。

1 资料与方法

1.1 标本采集 石蜡标本取自唐山市骨科医院及唐山市人民医院2002—2008年骨肉瘤手术石蜡标本55例 (实验组)。其中男41例，女14例，年龄12～57岁，平均 (25.3±8.4)岁。同时收集同一医院骨软骨瘤石蜡标本30例 (对照组)。选择肿瘤实质灰白色或灰红色外观区取材并进行常规病理染色，请专业病理医生确诊，后进行免疫组织化及细胞凋亡(TUNEL法)检测。

1.2 试剂及检测方法 免抗人FLIP多克隆抗体，工作浓度1∶100。免抗人NF－κB多克隆抗体，浓度1∶160。二抗两步法免疫组织化学试剂盒 (即用型)、细胞凋亡 (TUNEL)检测试剂盒。以上试剂均购自北京中杉生物技术公司。

石蜡切片4～5μm，实验组及对照组FLIP及NF－κB蛋白的表达强度应用免疫组织化学两步法检测。应用TUNEL法通过激光扫描共聚焦显微镜检测骨肉瘤组及骨软骨瘤组细胞凋亡。上述实验均设阳性对照及阴性对照以证明其准确性。

1.3 实验结果的判定 FLIP阳性为肿瘤细胞质出现褐色颗粒，NF－κB阳性则细胞核出现褐色颗粒。结果统计以每例中每张切片观察5个200倍视野 (×200)，对其中肿瘤细胞胞浆或胞核中阳性表达的褐色颗粒进行标记，计数所有检测视野中的阳性颗粒。经医学图像分析系统对各组结果进行平均光密度 (optical density，OD)检测及分析［3］。

TUNEL法检测细胞凋亡:石蜡切片按TUNEL检测试剂盒说明染色。在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞凋亡并计算凋亡指数 (AI)，即凋亡率计算方法:每张切片随机选取5个高倍 (×200倍)视野，计数凋亡细胞平均数，按公式计算凋亡率:细胞凋亡率=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0进行统计学分析。两组间均数的比较采用t检验;将骨肉瘤组FLIP，NF－κB蛋白表达的强度 (OD值)与凋亡率进行相关性分析，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FLIP和NF－κB蛋白在骨肉瘤中的表达 骨肉瘤组织中FLIP蛋白阳性位于骨肉瘤及骨软骨瘤细胞质内棕褐色 (见图1);而NF－κB蛋白则位于细胞核 (见图2)。骨肉瘤组织中阳性细胞体积较大，核大，可见核分裂像，呈弥漫分布。骨肉瘤组中FLIP蛋白表达强度高于骨软骨瘤，两组间差异有统计学意义 (p＜0.05)。NF－κB蛋白在骨肉瘤组织中表达强度高于骨软骨瘤组织，两组间差异有统计学意义 (p＜0.05，见表1)。

2.2 TUNEL检测骨肉瘤细胞凋亡 通过TUNEL方法经异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate，FITC)标记，用激光共聚焦显微镜观察，可见呈致密绿色荧光的凋亡细胞及凋亡小体 (见图3);实验组肿瘤细胞凋亡数 (17.586±0.817)%明显低于对照组的 (32.524±1.601)% (t=32.372，p＜0.05)。

2.3 FLIP的表达与骨肉瘤细胞凋亡的关系 采用直线相关分析，FLIP表达与细胞凋亡指数呈负相关 (r=－0.949，p＜0.01)。NF－κB蛋白表达与细胞凋亡指数亦呈负相关 (r=－0.877，p＜0.01)。经相关分析得出，二者表达呈正相关(r=0.971，p＜0.01)。

表1 FLIP和NF－κB蛋白在骨肉瘤中的表达 (x±s)Table 1 The expression of FLIP and NF－κB protein in osteosarcoma and osteochondroma groups

图1 FLIP蛋白表达于骨肉瘤细胞质 (IHC，×200)Figure 1 Positive expression of FLIPprotein in the cytoplasm of osteosarcoma cells

图2 NF－κB蛋白表达于骨肉瘤细胞核 (IHC，×200)Figure 2 Positive expression of NF－κB protein in the nucleus of osteosarcoma cells

图3 凋亡细胞及凋亡小体呈致密绿色荧光 (圆圈处为绿色荧光处，TUNEL，×400)Figure 3 The green fluorescence was found in apoptotic cells and apoptotic bodies

3 讨论

肿瘤发生发展过程中凋亡失衡机制起着重要作用。肿瘤细胞可通过不同机制逃逸受体介导的凋亡，使其得以继续生长。肿瘤细胞凋亡受抑是其发生、发展的标志。因此凋亡抑制蛋白在肿瘤中过度表达已成为抗肿瘤治疗的新靶点。设计药物去诱导肿瘤细胞的凋亡既可阻滞肿瘤细胞复制又可杀伤肿瘤细胞［4］。

凋亡抑制蛋白FLIP因能抑制Fas介导的凋亡，从而使肿瘤细胞过度生长，在许多类型肿瘤细胞中均呈过度表达。此外，FLIP还能阻断肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)、死亡受体 (DR4)等其他细胞表面死亡受体介导的凋亡信号的转导。因为它们的通路上具有FADD或Caspase－8的环节，FLIP的DED端可与之结合，阻止其后续环节，从而抑制凋亡［5－6］。

研究发现FLIP在恶性黑色素瘤、结肠癌、肺小细胞癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌等多种人类肿瘤中均呈过表达状态;而对应的正常组织或良性病变中，FLIP不表达或呈低水平表达。在一些对化疗药物有抵抗作用的恶性肿瘤中已发现有FLIP蛋白过表达。目前已经研制出针对凋亡抑制蛋白的反义寡核苷酸和小分子抑制剂，现正处于早期临床试用阶段［7－8］。本研究免疫组化结果显示:55例骨肉瘤中，FLIP蛋白表达的OD值明显高于骨软骨瘤，这与以往的文献报道一致。说明骨肉瘤的发生与FLIP蛋白高表达有直接关系，其机制可能是FLIP表达后与Caspase－8竞争在DED上的结合位点，从而阻断死亡受体 Fas、TNF－R1及 TRAIL介导的凋亡，使与Caspase－8相关的凋亡途径受到抑制，甚至中断。因此FLIP可能通过抑制癌细胞凋亡参与骨肉瘤的发生发展，FLIP具有抗凋亡作用并能在骨肉瘤的恶性进展中起重要作用［9］。

同时本实验采用TUNEL技术，对55例骨肉瘤及30例骨软骨瘤进行了细胞凋亡检测以探讨肿瘤细胞凋亡与FLIP的关系。结果显示:骨肉瘤组凋亡指数明显低于骨软骨瘤组。说明虽然骨肉瘤及骨软骨瘤均有细胞凋亡异常，但前者为分化差的恶性肿瘤，而后者为良性肿瘤，分化程度越低其凋亡的程度也越低。说明细胞凋亡通路受癌基因过度表达而受到抑制，相反，细胞凋亡与细胞增殖则成反比。一旦凋亡、增殖平衡被打破，机体不能及时清除恶变的肿瘤细胞，则以肿瘤细胞的增殖为主，恶性肿瘤发展迅速［10］。同时本实验又检测了骨肉瘤中FLIP蛋白表达与其细胞凋亡的关系，结果发现:FLIP蛋白表达与骨肉瘤细胞凋亡指数之间存在负相关。

NF－κB是广泛存在于各种细胞中的具有多向转录调节功能的核蛋白因子，参与机体的免疫炎症反应、细胞周期调控、肿瘤发生及细胞凋亡等。能与多种细胞基因的启动子和增强子中的κB序列位点特异性结合，上调转录活性，其可以调控一些细胞凋亡相关基因如FLIP基因、p53基因的转录表达，从而明显提高肿瘤细胞的抗凋亡能力。因c－FLIP基因编码序列中存在κB位点，故肿瘤细胞中高表达的NF－κB蛋白能上调FLIP的转录表达，使肿瘤细胞逃避Fas、TRAIL介导的凋亡信号的调控。此外NF－κB不仅参与细胞恶性转化，还能通过肿瘤细胞增殖与凋亡的平衡失调参与恶性肿瘤的浸润与转移［11］。无论是良性增生性病变还是恶性肿瘤的发生，所导致的NF－kB活化，其主要作用都是抑制细胞凋亡，故在一般情况下，NF－kB均被认为是凋亡抑制因子，在恶性肿瘤中均呈明显高表达。

本研究结果显示:骨肉瘤组织中NF－κB蛋白阳性明显高于骨软骨瘤。表明骨肉瘤增殖速度高于骨软骨瘤且说明NF－κB的表达强度影响肿瘤的良恶性程度。关于NF－κB致癌机制，目前倾向于通过上调抗凋亡基因或诱导TRAF(TNF受体相关因子)和IAP(凋亡抑制蛋白)而拮抗凋亡，亦可通过调节肿瘤细胞增殖或通过上调细胞周期蛋白表达而促进肿瘤的发生、发展［12－13］。本研究也发现骨肉瘤中存在NF－κB表达增强，且细胞核内有强阳性信号出现，说明NF－κB在核内存在活化，提示NF－κB在骨肉瘤的发生发展中发挥着重要的作用。

关于FLIP与NF－κB蛋白在骨肉瘤组织中的表达及相互关系的相关研究报导尚少见。相关研究认为，NF－κB的异常表达与活化可以诱导FLIP的表达，而FLIP在NF－κB发挥抗凋亡过程中起着重要作用。Okano等［14］在进行肝细胞癌的相关研究时发现，c－FLIP的过度表达可激活NF－κB，而c－FLIP表达下调时能减弱TNF－α等诱导的NF－κB的活化。本实验发现，骨肉瘤组织FLIP与NF－κB表达之间存在着一定的正相关关系，表明两者在骨肉瘤发生发展中存在促进作用，共同参与骨肉瘤的形成。

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