循环酶法双试剂测定血清同型半胱氨酸的方法学评价

焦文学，王 洁（甘肃省陇南市第一人民医院检验科 453000）

近年来研究表明，同型半胱氨酸（Hcy）与冠心病、脑卒中、弥漫性脑动脉硬化、糖尿病肾病等疾病关系甚为密切［1-2］。最早检测Hcy是氨基酸分析法，Ueland等测定血清中Hcy，后经改良，目前常用方法为高效液相色谱法（HPLC）、荧光偏振免疫检测法（FPIA）和酶免疫分析法（EIA）。HPLC是经典的参考方法，其操作比较复杂、试验耗时比较长、试验数据变异比较大，在临床应用方面逐渐被FPIA和EIA所取代。但FPIA存在价格昂贵的缺点，EIA存在大部分操作还是手工操作，比较耗时等缺点［3］，所以两种方法不适用于各级实验室，尤其是基层医疗单位的推广。近年来，由于Hcy检测技术的发展，对其研究逐渐深入，循环酶法因为具有快速、简便、灵敏度高，易于自动化等特点，逐渐成为适用于各级实验室的常规检测方法。本文对循环酶法双试剂测定血清Hcy进行了方法学评价。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择2010年1月至2011年11月本院门诊和住院的患者97例，其中男52例，女45例，年龄31～86岁，平均（41.7±10.3）岁。

1.2 仪器与试剂 日立7180型全自动生化分析仪。Hcy检测试剂（浙江伊利康生物技术有限公司）包括试剂Ⅰ：腺苷甲硫氨酸（浓度为0.1mmol／L）、三（2－羧乙基）磷氯化氢（浓度为0.5mmol／L）、谷氨酸脱氢酶（20 k U／L）；试剂Ⅱ：Hcy水解酶（3.0 k U／L）、Hcy基转移酶（3.0 k U／L）；2个水平的 Hcy标准液（分别为0.0和28.0μmol／L）。

1.3 测定原理 样品中的氧化型Hcy被还原剂还原成游离型Hcy，游离型Hcy与试剂中的底物和酶发生反应引起吸光度变化，通过检测反应中的吸光度变化的速率，可以计算出待测样本中Hcy的浓度。

1.4 测定方法 生化分析仪基本参数设置：反应类型为速率A法；波长340 nm（主）／405 nm（副）；37℃反应10min，读数时间23～31点，样品量8μL，R1量125μL，R2量25μL。

1.5 方法学评价指标 进行方法的回收试验、干扰试验，精密度、线性范围及方法对比试验。

1.5.1 精密度评价 按照 NCCLS（EP5－T2）文件的评价方案，取浓度为12.0和28.0μmol／L的 Hcy质控品各一份，用循环酶法将此两份标本每天上午、下午双份测定，连续20 d。

1.5.2 回收试验 向500μL血清中加入50μL的生理盐水作为基础样本，测得Hcy浓度为8.5μmol／L，向同体积的血清标本中分别加入50μL的浓度为50.0和200.0μmol／L的Hcy纯品，使其终浓度分别为12.3和25.9μmol／L，每一浓度作平行管。

1.5.3 线性试验 取高值样本用蒸馏水稀释成5个不同浓度的样本，每个样本重复测定3次，计算出回归方程Y＝a＋b X及线性误差（相关系数）r2。

1.5.4 干扰试验 以浓度为12.3μmol／L的 Hcy为基础血清，加入不同浓度的干扰物，同时对相同体积的蒸馏水作为基础样品，同时进行测定，计算加入干扰物质后的测定结果与基础样本的测定结果之间的偏差。

1.5.5 方法比较 选择 Hcy浓度在5.2～65μmol／L的临床血清标本30份，分别用本法（Y）和酶免疫分析法（X）测定，每份样品作双份测定，结果取均值。

1.5.6 参考值范围测定 选用150名体检结果正常、肝肾功能试验等各项理化指标正常的门诊体检者的空腹血清标本，年龄在17～63岁之间，其中，男92例，女58例。

2 结 果

2.1 精密度及回收率 结果批内CV分别为2.85%、1.88%；日间 CV 分别 为4.26%、3.19%，总 CV 分别 为6.35%、5.33%。测得其回收率为93.5%～97.7%。

2.2 线性试验及干扰试验 线性相关方程Y＝0.982 1 X＋0.054 7，r2＝0.999 6。干扰试验结果表明，三酰甘油浓度小于或等于10mmol／L，血红蛋白浓度小于或等于4.5 g／L，维生素C浓度小于或等于500 mg／L，胆红素浓度小于或等于300 μmol／L时，血氨小于或等于70μmol／L时，偏差均小于5.0%，说明上述浓度的物质无明显干扰。

2.3 与ELA比较 本法和ELA比较，Y＝1.040 0 X－0.549 8，r2＝0.995 9，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 参考值范围测定 Hcy结果的频数分布均为非正态性分布，男女之间结果差异有统计学意义（P＜0.05）。取95%置信区间确定的参考范围为：男性4～18μmol／L，女性2～13 μmol／L。

3 讨 论

Hcy是人体内含硫氨基酸的一个重要的代谢中间产物、可能是动脉粥样硬化等心血管疾病发病的一个独立危险因子。血浆中Hcy含量与遗传因素、营养因素、雌激素水平、年龄因素等有关，与Hcy代谢有关的N5N10－亚甲基四氢叶酸还原酶和胱硫醚－β－合成酶的基因突变，酶活性下降，也可引起高Hcy血症［5］。血清Hcy浓度测定近年来受到广泛重视，本试验所应用的酶速率法测定血清Hcy反应原理基于小分子捕获技术SMT的S－腺苷Hcy水解酶在TCEP作用下［5］，氧化型Hcy转化为游离型 Hcy，游离型Hcy与共价底物S－腺苷甲硫氨酸（SAM）催化反应形成甲硫氨酸与S－腺苷同型半胱氨酸（SAH）。SAH被SAH水解酶水解成腺苷和Hcy，形成的Hcy可以循环加入反应，从而放大了检测信号。本研究取95%置信区间确定的参考范围为：男性4～18μmol／L，女性2～13 μmol／L，与文献［6］有一定差距。为利用酶促反应及还原性辅酶Ⅰ的变化来测定血清Hcy的一种崭新的化学性方法，做到从免疫到化学的过渡，本法与之前所使用的循环酶法比较，以前是采用三试剂，而现在采用的是双试剂，更适合在多种自动化分析仪上测定，灵敏度高，线性范围宽，抗干扰因素强，精密度较好，值得各级医院推广使用。

［1］顾炳权，王多宁.血浆同型半胱氨酸水平及临床诊断意义［J］.中国血液流变学杂志，2004，14（4）：630－634.

［2］肖飞，郭健.血液中同型半胱氨酸的检测及意义［J］.临床检验杂志，2000，18（1）：56－57.

［3］吕伟标，罗玲.检测同型半胱氨酸的方法学进展和评价［J］.临床和实验医学杂志，2008，7（7）：175－176.

［4］胡红岩，刘建刚，崔云龙，等.血液同型半胱氨酸的测定方法及临床意义［J］.国外医学临床生物化学与检验学分册，1999，20（6）：254－255.

［5］Roberts RF，Roberts WL.Performance characteristics of a recombinant enzymatic cycling assay for quantification of total homocysteine in serum or plasma［J］.Clin Chim Acta，2004，344（1－2）：95－99.

［6］Malinow MR，Bostom AG，Krauss RM.Homocyst（e）ine，diet，and cardiovascular diseases：a statement for healthcare professionals from the Nutrition Committee，American Heart Association［J］.Circulation，1999，99（1）：178－182.