蛹虫草人工液体发酵的研究进展

申爱荣， 谭著明, 曾粮斌

(1.湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004； 2.中国农业科学院麻类研究所， 湖南 长沙 410205)

蛹虫草人工液体发酵的研究进展

申爱荣1， 谭著明1, 曾粮斌2

(1.湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004； 2.中国农业科学院麻类研究所， 湖南 长沙 410205)

概述了近年来蛹虫草在菌种选育、液体发酵上的研究进展，探讨了蛹虫草今后研究重点，以期为蛹虫草人工发酵产业化发展提供参考。

蛹虫草; 人工液体发酵; 研究进展

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)又称北冬虫夏草，属麦角菌科(Clavicipitaceae) 虫草菌属(Cordyceps)。蛹虫草中含有多种能提高人体免疫力的生物活性物质，如蛹虫草菌素(cordycepin)、虫草多糖(cordycepic polysaccharide)和虫草酸(cordycepic acid)等。它的主要化学成分与冬虫夏草基本相同，对于生长环境的要求较冬虫夏草低，可以通过液体发酵生产菌丝体，或人工大规模固体培养获得子实体。虽然蛹虫草可以通过人工固体培育获得子实体，但与液体深层发酵相比所需时间长，耗时耗力，而液体深层发酵培养基来源丰富，条件易于控制，生产周期较短，产量稳定[1]。因此，近年来蛹虫草液体深层发酵取得了迅速的发展。笔者综述了近年来蛹虫草在菌种选育和液体深层发酵上的研究进展，以期为蛹虫草人工发酵产业化发展提供参考。

蛹虫草中糖、脂肪和蛋白质的总含量高达60%以上，且蛋白质含量较高，脂肪含量较低，可满足人们对高蛋白低脂肪的滋补保健品的要求[1]。蛹虫草中还含有18种氨基酸、30 多种微量元素和多种维生素，以及含量高于冬虫夏草的甘露醇、虫草素、腺苷等活性成分，尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、多糖、甘露醇、虫草素、甾类、超氧化物歧化酶( SOD) 等生物活性物质的高含量,使得蛹虫草具有抗肿瘤、抗菌、保护肝肾及呼吸系统、抗氧化、调节免疫力以及调节内分泌与抗疲劳的药理作用, 对慢性支气管炎、肝炎、高血压、心脏病、肾炎、肾衰、癌症及消除疲劳、紧张等有显著的冶疗和预防作用[1-2]。

1 蛹虫草菌种的选育

菌种选育是筛选高产优质蛹虫草生产菌株的关键。菌种的选育方法比较多，常用的方法有菌落形态观察法、海选法、化学诱变、物理诱变、原生质体融合和基因改良。袁雪芬[3]通过从子实体上分离菌株的菌落形态观察，并从中选取部分进行子实体产生实验。结果表明，菌落颜色为杏橙色且气生菌丝较少的菌株摇培后菌丝球较小而且密集，出草率及产量均高。孙军德等[4]通过对5株蛹虫草的菌丝形态、生长速率、液体培养生物量和胞外多糖、人工栽培和子实体中活性物质虫草多糖与虫草素的对比研究，筛选出优良的蛹虫草菌株。胡事君等[5]阐述了菌种与培养方法相互筛选的技术方案。陈宏伟等[6]通过大量筛选菌株，筛选出来富锗能力最强的菌株28号和14号，在锗浓度为500μg/mL时，生物量分别为15.09mg/mL和13.84mg/mL，有机锗转化率可分别达到2.3%和1.9%。翟景波等[7]采用亚硝基胍进行诱变，成功选育出1株高产蛹虫草诱变菌株H4025。王陶等[8]采用离子束注入蛹虫草，选育出富锗能力强的10号菌株，在锗浓度为200mg/L时，菌丝体内的锗含量，比诱变前增加61.25%。周礼红等[9]通过对蛹虫草原生质体进行紫外诱变, 筛选到1株优良的菌株CMM-81, 虫草菌素含量是出发菌株的2倍, 经过连续15 代传代培养, 虫草菌素和腺苷的含量保持稳定。熊承慧等[10]通过真菌转化方法将来源于构巢曲霉的GPx基因分别转化到已经退化菌株的ZYF和能够正常结实的CM01两株不同的蛹虫草菌株中进行过量表达。在转入谷胧甘肤过氧化物酶后，ZYF菌株可恢复子实体生长的能力，而CM01菌株能够在继代过程中持续维持性状稳定性。

2 蛹虫草液体深层发酵

蛹虫草菌丝体的液体深层发酵是发展蛹虫草产业化生产的新途径，因其菌丝体生长快，生产周期短，可大规模工厂化生产，开发前景好。蛹虫草菌丝体的生长和其代谢产物的产生与蛹虫草发酵培养基的配方及发酵条件的控制有着直接关系，因此要在蛹虫草的液体深层发酵上取得突破，首先需要做好蛹虫草菌种的选择，其次是筛选出适合该菌种的发酵培养基和培养条件。从20世纪90年代起，研究人员在菌种的分离和筛选、培养方式、培养条件、培养过程中次生代谢产物的产生和动力学变化等方面进行了大量的研究。同时还在菌种诱变(包括化学诱变，原生质体融合和基因改良)、液体深层发酵、次生代谢产物的提取和纯化、与代谢产物相关的基因的克隆及调控、蛹虫草子实体的人工培养、蛹虫草产品的开发等方面进行了深入的研究和探讨，为蛹虫草的人工发酵和人工栽培开拓了新思路。

2.1 培养基的优化

培养基配方对蛹虫草液体培养生产有效成分如虫草素、腺苷、SOD、菌丝体等有着明显的影响。温鲁等[11]认为蚕蛹粉、豆粕和豆粉都是蛹虫草液体发酵培养基中很好的氮源，碳源水平为3%～4%，振荡培养8d，每瓶可产虫草素和腺苷10mg以上。尹萍等[12]对北虫草菌的液体发酵培养基进行了优化，研究表明发酵培养基以蔗糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.10%为主，在接种量5%、培养温度25℃、转速150r/min的条件下振荡培养4d，菌丝体产量较高。汪宇等[13]通过选择碳、氮、无机盐的三因素三水平正交试验，对蛹虫草2001-A深层发酵培养基进行优化。最适培养基组成为玉米粉2%、蛹粉0.5%、MgSO40.05%。菌丝体干重可达0.812g/50mL(4d)。雷坤等[14]以发酵液中虫草素的含量作为指标，优化得出蛹虫草Fjnu-01菌株产虫草素的最适碳源为蔗糖+玉米粉，最适合氮源为蛋白胨，最适生长因子为VB1，最适pH为6.4。最适培养基配方为：蔗糖2.80%；玉米粉0.54%；蛋白胨1.91%；KH2PO40.28%；MgSO40.15%；VB10.11‰。

2.2 发酵条件的研究

发酵条件如发酵初始pH值、发酵温度、发酵时间等对蛹虫草的发酵产物影响显著。陈晋安等[15]提出蛹虫草液体深层发酵的适宜的培养条件为：发酵温度25℃，发酵初始pH值7.0，发酵周期6d。还提出在摇瓶条件下通气量对菌体生长的影响相对较小。周广麒等[16]研究出蛹虫草在30L生物反应器中发酵条件：初始温度22℃，初始pH值6.3～6.5，搅拌速度180r/min，通风量1.21m3/h，发酵72h和96h，蛹虫草菌丝体(干)产量分别为38.6g/L和42.3g/L。王英臣[17]分析不同因素对胞外多糖得率的影响，确定蛹虫草胞外多糖发酵培养条件为：pH值6.5，温度20℃；此条件下蛹虫草胞外多糖得率为1.188g/100mL，菌丝体干重为1.221g/100mL。郑婷婷等[18]研究出蛹虫草菌丝体液体摇瓶最佳培养条件为接种量10%(v/v)，发酵初始pH值7.0，发酵温度27℃，发酵时间96h。杨杰等[19]以蛹虫草菌丝生物量为指标，对发酵罐培养工艺进行优化，确定最佳接种量为20 瓶(500mL)/罐(60L)，装液量为35L/罐，通气量为0.9m3/h，最适的起始pH值6.45。康超等[20]考察不同液体发酵方式对虫草素积累的影响，发酵16d后，08Y1菌株在黑暗振荡培养条件下，虫草素积累达1015.0mg/L。另外，国外的Park[21]和Kim[22]等也对蛹虫草液体深层发酵最适条件和胞外多糖的最适生产条件进行了相应的摸索。

2.3 外源添加物

外源添加物如嘌呤类似物、邻苯二甲酸二丁酯、金属离子等能显著增加蛹虫草发酵产物中某种成分的产量。王蕾等[23]比较8种营养添加物对虫草发酵过程中虫草素积累的影响，结果表明：添加腺苷、腺嘌呤、丙氨酸、L-天冬氨酸、甘氨酸5种物质，对虫草素合成的促进作用均较明显，均能有效提高蛹虫草液体发酵虫草素的产量。李祝等[24]研究表明：选用浓度为6%的邻苯二甲酸二丁酯分别在08-03摇瓶培养到24h和120h时加入，继续培养到196h，收集菌丝体，虫草菌素总产量分别比未添加邻苯二甲酸二丁酯的对照组提高了7.48倍和7.09倍。杜双田等[25]以蛹虫草菌株CM-003为试材，采用常规瓶栽法研究不同质量浓度亚硒酸钠对蛹虫草长势、子座产量及子座硒含量的影响，结果发现，随着亚硒酸钠质量浓度的增加，蛹虫草的长势评分和子座产量呈先增加后减小的趋势，子座硒含量呈逐渐增加趋势。康超等[20]考察了添加前体物质(腺嘌呤1g/L+甘氨酸16g/L)，发酵16d后检测虫草素和腺嘌呤含量。结果表明：08Y1菌株在黑暗振荡培养条件下，虫草素积累达1015.0mg/L，腺嘌呤利用率达98.5%，说明黑暗振荡培养并添加前体物质是提高虫草素产量的有效方法。

2.4 发酵产物的分离

通过液态深层培养可以快速生产蛹虫草菌丝体，还可通过优化发酵条件，提高其生物活性物质的含量，方便目的组分的提取[21]。张红霞等[27]用高效液相色谱法同时检测了5株北冬虫夏草菌株发酵液中虫草素和腺苷的含量，并系统地研究了各种发酵条件对虫草素和腺苷含量的影响。结果表明，虫草素和腺苷在所设色谱条件下得到了很好的分离，二组分的线性关系良好，其中虫草素峰保留时间为11.443min，腺苷峰保留时间为9.054min；虫草素的回收率为103.22%，RSD=4.4%，腺苷的回收率为98.42%，RSD=3.2%；虫草素和腺苷的线性范围分别为0.49～98μg/mL，0.46～92μg/mL。

3 展望

目前，关于蛹虫草液体深层发酵的研究比较系统和深入，但仍存在不足之处。首先，蛹虫草本身不具抗菌能力，易受到杂菌的污染，而且蛹虫草液体深层发酵周期相对较长，一般10～15d，长的多达20d，子实体培养周期更长，长达几个月，要完全保障其不受污染，需要加强对蛹虫草专用液体发酵器的研制和开发，而现阶段该方面研究很不够，所用的发酵器主要是市面上能购买的生物发酵罐，价格昂贵，且清洗困难，尤其是到菌丝生长后期，罐内菌液粘度大，耗能大；其次蛹虫草菌种分离过程中菌体消亡严重，继代培养退化严重，菌种在培养3～5代即会出现严重退化，需要不断复壮，加大了菌种保存的难度；再次，对蛹虫草液体深层发酵过程的动态变化知之甚少，缺乏该方面的研究和对发酵过程的动态监测。

因此，今后研究应该在以下几个方面加强。首先，加强蛹虫草专用发酵器的研发，设计生产出价格低廉的且适合虫草等长周期连续发酵的新型发酵罐。其次利用物理化学诱变、原生质体融合和基因改良进行菌种的选育，筛选一批高产优质的生产菌株用于工厂化生产。同时加强发酵培养基和发酵条件的优化，加强发酵过程的动态监控研究，提高菌种对发酵培养基的利用率，为蛹虫草的合理开发和利用打下坚实的基础。

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(文字编校：杨 骏,龚玉子)

ResearchadvancementofartificialfermentationofCordycepsmilitaris

SHEN Airong1, TAN Zhuming1， ZENG Liangbin2

(1.Hunan Academy of Forestry Changsha 410004, China; 2.Institute of Bast Fiber Crops, CAAS, Changsha 410205, China)

The research advancement were reviewed in the breeding, liquid fermentation and discussed the future research emphasis ofCordycepsmilitaris, to look forC.militarisfermentation industrial development to provide reference.

Cordycepsmilitaris; artificial liquid fermentation; research advancement

2012 — 09 — 15

2012 — 10 — 12

中央财政林业科技推广项目([2011]XT 003)。

申爱荣(1980 — )，女，湖南省邵东县人，助理研究员，主要从事森林微生物资源利用方面的研究。

TQ 920.1

A

1003 — 5710(2012)05 — 0142 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2012. 05. 039