肿瘤细胞体外药敏试验临床研究进展

段国辰 杜锦波 牛占丛

恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病，近年来其发病率和病死率都有明显的增高趋势［1］。恶性肿瘤治疗包括手术治疗、放射治疗、化学治疗和生物治疗。其中化疗可以杀死血液里的肿瘤细胞，作为全身治疗已成为肿瘤治疗的不可替代的方法。但化疗存在主要问题是肿瘤细胞对化疗药物不敏感，抗癌药物的毒副作用。目前临床使用的抗癌药物均有不同程度的毒副作用，这是目前由于抗癌药物对肿瘤细胞的选择性不强，在杀伤肿瘤细胞的同时对正常组织细胞也有损伤作用，产生毒副作用。这些是肿瘤化疗失败的主要原因，也是肿瘤化疗急需解决的难题。在化疗前准确选用有效的化疗药物进行个体化疗是解决这一难题的根本途径。因此进行抗肿瘤药物敏感试验已成为当今癌症研究的主攻课题之一，多年来人们一直努力寻找简便、准确、又切实可行的药物敏感实验，本文旨在通过个体化疗，提高疗效，减少毒副作用。就肿瘤体外药敏实验临床研究进展作一综述。

1 肿瘤细胞体外药敏实验的意义

化疗在恶性肿瘤以手术为主的综合治疗中占有重要地位，其在恶性肿瘤的治疗中越来越受到重视。化疗为全身治疗，可以有效的杀死肿瘤细胞，提高远期生存率及生活质量。但目前术前和术后的化疗也逐渐显露出很多问题:术前化疗有可能无法取得患者的病理类型、术后患者虽然取得确切的病理类型然而个体间存在明显的差异性，相同病理类型的患者对同一种化疗药物的敏感性不同，这些因素都可能影响治疗效果。目前的经典化疗方案来源于大样本、多地区的统计资料，缺乏个体化。有些肿瘤患者病理类型甚至临床分期都相同，却对化疗药物的敏感性有很大的不同，使得这些患者的疗效和生活质量存在较大的差异性。目前，应用肿瘤的原代细胞对临床常用的化疗药物做体外药敏试验进而指导肿瘤患者的个体化化疗的研究越来越受到重视［2，3］。不论术前、术后，肿瘤原代细胞的药物敏感性研究都将为患者个体化化疗提供实验依据和理论指导。日本卫生部早在1999年就将肿瘤药敏试验正式批准为一种“先进的临床医学技术”在各大医院中广泛的应用，此后药敏实验在日本得到了迅猛的发展［4］。Nakamura等［5］做了大量的胃癌患者的原代细胞对化疗药物的敏感实验，以胃癌患者的3年生存率作为判断指标，最后得出胃癌患者的肿瘤原代细胞化疗药物敏感组的3年生存率比传统化疗组、和不接受化疗组的明显提高。检测药物敏感性有很多方法，其中四氮唑盐(MTT)比色法是一种为肿瘤患者筛选化疗药物的经典方法，它使用了96孔板使得操作半自动化，使得整个实验过程简单、快速、能够处理大样本，减少因操作时间长而导致的可能污染［6］。MTT法被广泛用于肿瘤细胞的抗癌药物敏感实验及其筛选最佳的化疗药物组合为个体化化疗提供实验基础［7］，在很大程度上避免耐药性的发生，减少了盲目性用药，减少了肿瘤的复发和远处转移，提高了5年生存率［8］。MTT比色分析法为肿瘤患者的个体化化疗提供了一条可行的、有效的、精确的实验手段。MTT比色分析法能够用于人体多种肿瘤细胞，其应用范围十分广泛。早在20世纪80年代初已经采用MTT法作为急性白血病临床筛选化疗药物的实验依据，并且疗效显著。直肠癌原代细胞进行MTT比色分析法得出的最佳化疗组合与临床经典的化疗方案不完全一致，MTT敏感组的近期临床有效率及3年生存率明显高于对照组与MTT不敏感组。不同化疗方案对同一个肝癌患者的疗效不同，即敏感性有显著差异。不同的肝癌患者虽然病理类型，临床分期相同但对同一种化疗药物的敏感性亦不同。应用MTT敏感的化疗药物其临床缓解率明显高于经典化疗方案对肝癌患者的缓解率。有报道:已将MTT药敏试验作为临床脑肿瘤化疗药物筛选的一种可靠方法［9］。刘毅等［10］以MTT比色分析法结合流式细胞仪分别检测细胞抑制率和细胞凋亡率，以这两个指标为基础筛选出适合患者的化疗药物，避免了用药的盲目性，避免了耐药性的发生，使卵巢癌患者的缓解率较经验化疗组明显提高。因此通过MTT比色分析法来进行原代细胞的药物敏感试验将对化疗药物的选择提供实验手段，并且能够帮助预测患者的预后，为患者远期疗效提供实验指导［8］。总之，将体外药敏实验技术应用于肿瘤患者的化疗将大幅提高患者的生活质量和远期存活率。然而MTT比色分析法在实际应用中仍然面临着诸多问题:首先MTT法在应用中尚未形成一套严格的实验标准，各国、各研究人员依靠着不同的实验依据而采用的化疗药物浓度、MTT浓度、肿瘤原代细胞的浓度、化疗药物与肿瘤细胞作用时间、MTT与肿瘤细胞作用时间等关键性的步骤均有所不同，在很大程度上限制了MTT法的临床应用，不利于各研究机构的实验结果比较。魏文清等［11］经过研究证实:不同系统的肿瘤、应该采用不同的细胞浓度。肿瘤细胞与化疗药物的作用时间一般以48 h为宜。MTT与肿瘤细胞作用时间以6 h为宜。在这样的条件下，实验效果较好。所以MTT比色分析法仍需要发展与完善，使其能够更加科学的应用于肿瘤患者的个体化化学治疗中，从而最大程度的发挥其不可替代的作用，应推广肿瘤原代细胞药敏技术、并将其规范化、标准化，其对临床有着无可估量的应用价值，能够筛选出完全适合患者的化疗药物，对传统化疗药物的改革、新药的开发与应用都有着非常重要的实际意义，也为肿瘤患者的个体化治疗提供理论依据，对肿瘤患者的个体化治疗具有重要的意义［12，13］。

2 外周血淋巴细胞替代肿瘤细胞行体外药敏试验的可行性

临床上经常遇到以下问题:由于各种原因无法取得肿瘤标本;随着化疗次数的增加敏感药物可能也会有所改变;肿瘤细胞难以纯化、非肿瘤成分多容易干扰药敏结果;肿瘤组织污染较重，明显影响药敏结果，上述情况临床上又需要及时、准确的获得药敏实验数据。有研究证实，不同患者对化疗药物所表现出的敏感性差异与其遗传有很大关系，同一个体的不同体细胞与突变的肿瘤细胞在基因组上是完全相同的，外周静脉血淋巴细胞同肿瘤细胞一样具有耐药基因的表达［14］。尽管由于不同条件的存在使得具有相同基因组的不同细胞、不同组织在生物特性上有着较为明显的差异，但面对相同外界打击的条件下，所表现出的抗打击反应潜能是相似的［15］。所以用肿瘤患者外周静脉血淋巴细胞替代肿瘤细胞进行药物敏感试验来筛选化疗药物在理论上是可行的。艾军等［16］报道:外周静脉血淋巴细胞同肿瘤细胞在体外对同一种化疗药物在敏感性上具有良好的一致性，并且这两种细胞在抗癌药物作用下所表现出的平均抑制率为正相关。王艳萍等［17］以MTT方法为基础测定了74例肺癌患者癌细胞及其自身外周血淋巴细胞对临床上常用的15种化疗药物的敏感性，结果肺癌细胞与自身外周血淋巴细胞对其中12种化疗药物的敏感性有着良好的正相关性，且有统计学意义。袁淑兰等［18］通过MTT法检测神经胶质瘤患者肿瘤细胞和外周血淋巴细胞对临床常用化疗药物的敏感性，结果为肿瘤细胞与自身外周血淋巴细胞对化疗药物的敏感性有良好的正相关性。所以对于由于失去手术机会，无法获得肿瘤组织的患者，或多次化疗可能产生耐药性的患者，用其外周静脉血淋巴细胞代替肿瘤细胞进行化疗药物的药敏试验，进而对化疗药物筛选是可行的。

3 肿瘤细胞体外药敏差异性的可能发生机制

相同病理类型的患者对同一种化疗药物的药物敏感性差异与其耐药相关蛋白的表达水平有很大的关系。铂类药物(包括顺铂、卡铂等)是非小细胞肺癌化学治疗中最常用的药物之一，它通过与DNA结合，形成铂-DNA加合物从而导致DNA的交链反应，进而干扰DNA转录和复制，通过此机制来抑制肿瘤细胞的分裂、生长起到杀死肿瘤细胞的作用。研究证实切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementation group 1，ERCC1)在人类多种脏器恶性肿瘤细胞中均有表达［19，20］，ERCC1的表达水平与铂类化疗敏感性的差异关系紧密，ERCC1可以修复化疗药物铂类导致的DNA损伤，从而进一步致使肿瘤对铂类的耐药，ERCC1高表达者会导致铂类耐药，所以ERCC1可较好的作为铂类化学治疗敏感性的预测基因［21］。Olaussen等［22］对761个非小细胞肺癌患者的肿瘤组织进行ERCC1的检测，并进行铂类药物的化学治疗，结果发现:ERCC1表达阴性的患者较阳性患者对铂类药物敏感。近来也有报道，ERCC1的表达与肿瘤细胞对铂类的耐药有关［23］。

肺癌耐药蛋白(lung cancer resistance protein，LRP)，在形成NSCLC的耐药机制中受到越来越多的重视。LRP是肿瘤多药耐药(multi-drug resistance，MDR)性中的一个重要蛋白。LRP蛋白被国内外很多专家认为可以预测化疗敏感性［24］。LRP蛋白的作用机制与药物的外排作用和溶酶体的作用有关。通过药物外排作用而很大程度上减少化疗药物的积累，以降低化疗药物的绝对浓度。另外LRP对细胞核、细胞质的运输有重要作用，它通过改变化疗药物在细胞核、细胞质中的分布比例，而达到降低药物的有效作用浓度。通过以上作用机理导致肿瘤细胞内有效的化疗药物浓度下降，当化疗药物浓度低于治疗浓度的阈值便会进而引起耐药性的发生。很多研究证实LRP的表达与肿瘤的病理类型有关，一般为LRP在腺癌中的表达水平明显高于鳞癌，但LRP的表达水平与性别，年龄、是否抽烟、肿瘤分化程度、淋巴结有无转移无相关性［25，26］。人类多种脏器肿瘤中均有LRP的表达，并且LRP的表达水平和这些肿瘤对化疗药物的敏感性差异紧密相关，LRP在肿瘤组织中高表达者化疗疗效差，预后也较低表达者差［27－29］。Berger等［30］对 16 例非小细胞肺癌进行体外研究证实，LRP蛋白表达阳性的肺癌细胞耐药性强，对化疗药物不敏感。LRP蛋白为人类穹隆体主蛋白，通过药物的外排作用导致细胞对许多化疗药产生耐药性，如丝裂霉素、烷化剂和顺铂等［30］。

胸苷磷酸化酶(Thymidine phosphorylase，TP)是一种由2条多肽链所构成的二聚体，TP与肿瘤的化学治疗有着紧密的关系，它能增强肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性，提高化疗效果，从而改善患者的预后。TP的表达水平与肿瘤内的微血管密度有良好的正相关性。TP一般表达于细胞膜，而且周围正常组织内TP的密度明显低于肿瘤组织内的密度。研究认为TP是嘧啶核苷代谢过程中的一个关键酶，TP能够催化5-Fu前体药在肿瘤细胞内的激活，从而提高肿瘤细胞内的5-Fu的浓度，从而增加5-Fu的化学治疗效果。肿瘤细胞内高TP活性能保持细胞内5-Fu的高浓度从而才能最大程度的抑制肿瘤［31］。Meropol等［32］通过免疫组织化学染色技术将直肠癌中TP的表达水平与化疗敏感性和生存期之间的关系进行了统计分析，结果证实，TP的表达水平同化疗敏感性和生存期均有明显正相关性，即TP表达水平越高则对化学治疗越敏感、生存期也就越长，预后也就越好。所以检测肿瘤中TP表达水平可以很好的预测化疗是否有效。而且也有研究证实:TP表达水平与肿瘤的转移及患者的预后有关系［33］。但关于TP表达水平与预后的关系也有不一致的报道。恶性肿瘤的生长是伴随新生血管的生长而生长的。在没有新的血供条件下，一般肿瘤只能长到2mm3左右。新生血管往往是不连续的，发育也不完全，很多新生的血管基底膜也不完整，肿瘤的转移很可能是通过不完整的血管基底膜进入血液循环的。在非小细胞肺癌、胃癌等许多肿瘤中TP的表达水平与肿瘤自身的微血管的形成有着密切关系［34］。目前也有研究证实TP表达越强则肿瘤的侵袭性越强，预后也越差。

综上所述，肿瘤的体外药敏实验能够很好地指导临床工作，外周血淋巴细胞与肿瘤细胞在体外药物敏感性上有着良好的正相关性。当由于各种原因无法获得肿瘤细胞时，可以用淋巴细胞来替代肿瘤细胞进行体外药物敏感试验从而有针对性的选择化疗药物。但体外药物敏感试验仍有不足之处，体外实验无法考虑细胞毒性，无法科学的评估化疗药物对人体正常细胞的作用。体外药敏试验只是偏重于肿瘤细胞的个体化，但体外和体内还存在许多差异。体内药物主要通过肝、肾来修饰和代谢，另外体内还有一定的内环境，这些因素均可能改变药物的疗效，而体外实验则药物直接作用于细胞，无法真正模拟体内环境。肿瘤细胞具有异质性，随着肿瘤的发生、发展，药物的敏感性可能会有改变。ERCC1、LRP、TP在NSCLC耐药性的产生、化学治疗的疗效及预后等方面具有重要的参考价值。不同患者耐药相关蛋白表达水平的差异导致了即时具有相同病理类型的肿瘤细胞对同一种化疗药物的敏感性具有很大的差异性。然而耐药相关蛋白的调控机制十分复杂，各国、各研究机构对于耐药相关蛋白如何产生耐药性的机制仍不十分明确。耐药相关蛋白是否有协同作用也不清楚，需要更多的致力于体外药敏实验的研究，并找到药敏差异性的分子机制，这样才能更好地为肿瘤患者的个体化治疗提供理论指导。

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