新疆维吾尔族和汉族帕金森病LRRK2基因S1647T多态性研究

闫荟如，李红娟，杨新玲

0 引言

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种常见于中老年患者的神经系统变性疾病，遗传因素在其发病因素中起着重要作用，LRRK2是重要的易感基因之一。目前已证实LRRK2基因有20余个突变位点与PD相关，突变类型具有明显的地域和种族差异性。Zheng等［1］和台湾地区的Lin等［2］发现该多态性与中国汉族人群PD的发生有关。目前尚未见国外学者对S1647T多态性的研究报道。新疆维吾尔自治区地处中亚，维吾尔族具有与汉族不同的遗传背景，本研究选择新疆地区汉族和维吾尔族帕金森患者及健康对照者为研究对象，观察LRRK2基因S1647T位点多态性与维吾尔帕金森病发生的相关性及不同民族的差异。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 诊断标准病例组为在流行病学调查基础上收集的PD患者;均为散发性。对照组为从调查地点选择的生活背景与PD患者相似，年龄、性别、民族等相互匹配，并且经严格检查确定无血缘关系的非PD健康人。以英国BrainBank诊断标准［3］进行筛查，部分诊断困难者再由神经内科资深专家进行审核确诊，必要时行头颅磁共振或CT扫描辅助诊断［4-5］。发病年龄以50岁为界分为早发PD组和晚发PD组。排除继发性PD和帕金森叠加综合征以及神经系统其他疾病、甲状腺功能亢进、遗传性疾病等。

1.1.2 一般资料病例组354例，其中汉族183例，维吾尔族171例。汉族患者的男女比例为105∶78，发病年龄25～85岁，平均(61.9±11.5)岁。维吾尔族患者的男女比例为97∶74，发病年龄31～95岁，平均(62.1±12.3)岁。健康人对照组340名，其中汉族180名，维吾尔族160名。汉族人男女比例为100∶80，年龄27～86岁，平均(60.9±11.4)岁。维吾尔族人男女比例90∶70，年龄33～90岁，平均(61.1±11.4)岁。汉族和维吾尔族病例组和对照组的性别构成(χ2=0.098，P＞0.050、年龄差异(t=1.104，P＞0.05)均无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 DNA制备取肘静脉血2 ml按常规酚/氯仿法抽提基因组DNA，检测DNA纯度为1.7～1.9，浓度≥10 ng/μl，-20℃保存。

1.2.2 引物设计根据NCBI(National Center for Biotechnology Information)及Ensembl数据库中LRRK2基因S1647T所在的Exon34的DNA序列，设计S1647T引物。上游引物序列:5′-CTTCTAGGCCACATGGTTG-3′;下游引物序列:5′-TCCTATTGGCAAAGCAATCT-3′。扩增片断长度为326 bp，引物由北京华大生物公司合成。

1.2.3 扩增LRRK2基因第34号外显子PCR总体积为25 μl。100 ng/μl上下游引物各为0.5 μl，MIX 10 μl，50 ng/μl cDNA 3.0 μl，去离子双蒸水11 μl。PCR反应条件为:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57.8℃退火30 s，72℃延伸20 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.4 PCR扩增产物检测与基因型鉴定取7 μl PCR产物，加入上样缓冲液混匀后，上样于2%琼脂糖凝胶，核酸染料染色，D50 Marker为标准品，4 v/cm电压电泳20 min，紫外灯下观察拍照。扩增片段长度为326 bp。

1.2.5 RLFP分析酶切反应体系体积20 μl，包含PCR产物10μl，10×缓冲液2μl，NspI酶5U，去离子双蒸水7.5μl，置于37℃恒温箱中酶切5～24h。取出酶切产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外光凝胶电泳成像分析系统判断酶切结果。D50Marker作为标准品。部分样本进行DNA测序验证。

1.2.6 基因型分析TT型纯合子:276 bp+50 bp(野生型);TA型杂合子:326 bp+276 bp+50 bp;AA型纯合子:326 bp(纯合子突变，无酶切位点)。

1.2.7 统计学分析使用SPSS17.0软件进行数据分析。基因型频率及等位基因频率采用基因计数法，计数资料以例数和百分比(%)表示，两组间等位基因频率和基因型频率分布的比较采用χ2检验，基因型及等位基因的影响因素采用多因素Logistic回归分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验病例组与对照组的基因型多态性分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，吻合度良好。PD组χ2=0.021，P＞0.05，对照组χ2=0.733，P＞0.05。

2.2 LRRK2基因S1647T位点多态性PCR-RFLP野生型TT基因型分为276bp、50bp 2条带。杂合子突变TA基因型分为326 bp、276 bp、50 bp 3条带。纯合子突变AA基因型分为326 bp 1条带。电泳结果见图1。测序结果见图2，红色峰为TT基因型，红绿峰相间为TA基因型，绿色峰为AA基因型。

图1 LRRK2基因S1647T多态性的基因分型Figure1Genotypes of S1647T polymorphism in LRRK2 gene

图2 LRRK2基因S1647T多态位点测序图Figure 2 Sequence for S1647T polymorphism of LRRK2 gene

2.3 S1647 T基因型及等位基因频率分布比较

2.3.1 维吾尔族、汉族PD组和对照组S1647T基因型频率及等位基因频率比较汉族PD组TA+AA型基因频率和A等位基因频率明显高于汉族对照组，差异有统计学意义(χ2=6.441，P=0.04和χ2=5.389，P=0.02)，A等位基因携带个体发生PD的风险性高于未携带个体(OR=1.436，95%CI:1.058～1.950);维吾尔族PD组和维吾尔族对照组基因型频率和等位基因频率差异无统计学意义(χ2=1.10，P=0.577和χ2=0.000，P=0.999)。汉族PD组TA+AA基因型频率和A等位基因频率高于维吾尔族PD组，2组比较差异有统计学意义(χ2=6.127，P=0.047和χ2=4.299，P=0.038)，汉族A等位基因携带个体发生PD的风险增加(OR=1.387，95%CI:1.018～1.89)。结果见表1。

2.3.2 PD组和对照组基因型频率和等位基因频率比较差异无统计学意义(χ2=3.149，P=0.207和χ2=2.825，P=0.093)。不同年龄PD患者与对照者S1647T基因型频率和等位基因频率分布的比较，早发PD组与≤50岁对照组(χ2=4.485，P=0.106和χ2=3.699，P=0.054)，晚发PD组与＞50岁对照组(χ2=0.981，P=0.612和χ2=0.773，P=0.379)之间基因型频率和等位基因频率比较，差异无统计学意义。不同性别PD患者与对照者S1647T基因型频率和等位基因频率分布的比较，男性PD组与男性对照组(χ2=0.464，P=0.793和χ2=0.271，P=0.603)，女性PD组与女性对照组(χ2=4.115，P=0.128和χ2=3.820，P=0.051)基因型频率和等位基因频率比较差异均无统计学意义。

2.3.3 Logistic多因素分析在进行等位基因的二分类Logistic多因素分析时，以等位基因(A和T)作为因变量，将可能影响等位基因突变的因素，包括族别、性别、年龄和分组作为自变量，进行二分类的多元logistic回归分析结果显示，族别对等位基因A的突变有影响，其他因素均无影响。经Wald检验，不同民族的差异有统计学意义，P=0.012，说明族别与等位基因A的突变呈正相关，校正其他自变量的影响后，汉族等位基因A突变的OR(95%置信区间)为1.841(1.143～2.966)。结果见表2。

在进行基因型的无序多分类Logistic回归分析时，将基因型(AA、TT和TA)作为因变量，可能影响到基因型的因素包括族别、性别、年龄和分组作为自变量，进行无序多分类logistic多元回归分析，结果显示，族别对AA基因型和TA基因型有影响，其他因素均无影响。族别经Wald检验，P值均小于0.05，差异有统计学意义。AA基因型相对于TT基因型，汉族发生基因突变的OR(95%置信区间)为2.898(1.173～7.163)，P=0.021，差异有统计学意义。TA基因型相对于TT基因型，汉族发生基因突变的OR(95%置信区间)为1.835(1.105～3.047)，P=0.019，差异有统计学意义。结果见表3。

表1 维吾尔、汉族PD组和对照组S1647T基因型频率及等位基因频率比较［n(%)］Table 1 S1647T polymorphism allele and genotype frequency in Xinjiang Uygur and Han nationality，n(%)

表22 等位基因族别、性别、年龄、分组的二分类Logistic回归分析Table 2 Two alleles of nation，gender，age，group of binary classification Logistic regression analysis

表3 基因型族别、性别、年龄、分组的无序多分类Logistic回归分析Table 3 The chaos of the gene type more classification Logistic regression analysis of nation，gender，age and group

3 讨论

近年来，随着诸多PD相关易感基因的发现，遗传因素在PD发病因素中的重要作用日益受到重视。LRRK2基因又名PARK8，位于染色体12q2，全长7584个碱基，有51个外显子，是常染色体显性遗传PD中突变频率最高的致病基因。

LRRK2基因突变具有明显的地域和种族差异。G2019S和R1441C在欧洲和北非高加索人群中常见［6-8］，在亚洲的突变却非常少见，仅占LRRK2突变的0.1%左右。Mata等［9］最先报道G2385R是中国人群中特异的PD风险因子，，随后其突变研究成为热点。G2385R在马来人PD患者中突变频率为2.0%，但与PD发病无相关性，在印度及高加索等其他种族中均未检出该位点的多态性［10-12］。然而，在东亚各国和地区的散发性PD患者常见该位点突变，突变频率分别为:中国大陆10%，新加坡7.27%，日本11.6%，台湾8%［13］。R1628P是新近发现的突变位点，与G2385R类似，其携带者以杂合状态为主，是散发性PD的另一个风险因素［14］。Ross等［15］报道R1628P可能是中国人群中第二个特异的PD风险因子，与G2385R不同的是，在亚洲其他种族中未发现该位点突变，是汉族人群特异性的突变位点。

S1647T是除G2385R和R1628P之外又发现的与中国汉族PD发生有关的多态性位点。目前对该位点研究不多，Zheng等［1］研究发现该位点的A等位基因增加中国华南地区汉族人群PD的患病风险。台湾的Lin等［2］研究证实S1647T多态协同环境因素致使人群的PD患病增加。同时Chang等［16］研究结果也表明S1647T位点的突变增加了中国汉族人群PD的发病风险。目前尚未见国外学者对该位点的研究报道。在新疆地区不同民族间进行LRRK2基因多态性与PD易患性的研究有助于进一步揭示人类罹患PD的遗传学基础，为PD基因诊断及治疗提供新途径。

不同种族和地域PD患者的致病基因、突变位点及其表型均有所不同。本研究结果显示，LRRK2基因S1647T多态性以TT和TA基因型多见，AA基因型较少见。A等位基因频率在汉族PD组与汉族对照组之间存在差异，提示A等位基因可能增加了新疆地区汉族人群散发性PD的遗传风险，这与Zheng等和Chang等文献报道的结论一致。而维吾尔族PD组和维吾尔族对照组基因型频率和等位基因频率之间差异无统计学意义。由于LRRK2基因突变类型存在明显的种族及地域差异，新疆地区地处中亚，维吾尔族具有与汉族不同的遗传背景，该研究说明S1647T不大可能与新疆维吾尔族人群PD的发生有关，是中国汉族人群的突变热点。按年龄分组，该研究表明S1647T位点基因型频率及等位基因频率在早发PD组和≤50岁对照组、晚发PD组和＞50岁对照组、早发PD组和晚发PD组间均无统计学意义。与Chang等［15］研究证明的与早发型PD有关结论不同，该研究A等位基因频率在早发PD组为40.3%，大于晚发PD组(34.5%)和≤50岁对照组(29.6%)，这与样本量不足、抽样误差以及Chang等的研究对象主要来自四川有关，不同地区、种族、环境及生活习俗的差异可能导致不同的结果。

基因多态性与疾病的关系受到广泛关注。本研究在新疆地区进行LRRK2基因多态性的研究填补了国内外不同民族、地区PD患者LRRK2基因多态性研究的空白。所获数据表明S1647T多态性与新疆地区汉族人群PD发生具有相关性，与维吾尔族人群PD的发生可能无关，进一步证实了LRRK2基因突变的地域和种族差异性。今后有必要继续扩大样本量在其他地区和民族人群中对该位点进行进一步研究。

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