核糖体失活蛋白及其在生物医学领域的应用与研究进展＊

赵 婷，姚大卫，吴志斌，左雨鹏，邝咏衡，谢天顺，冯先玲综述，沙 鸥△，张 健▲

（1.深圳大学医学院基础医学系，广东深圳518060；2.香港中文大学医学院生物医学科学学院，香港999077）

核糖体失活蛋白及其在生物医学领域的应用与研究进展＊

赵 婷1，姚大卫2，吴志斌2，左雨鹏2，邝咏衡2，谢天顺1，冯先玲1综述，沙 鸥1△，张 健1▲

（1.深圳大学医学院基础医学系，广东深圳518060；2.香港中文大学医学院生物医学科学学院，香港999077）

核糖 体失活蛋白；N－糖苷酶；免疫毒素；细胞因子；逆向运输

核糖体失活蛋白（ribosome－inactivating proteins，RIPs）是一类具有特殊生物毒性的蛋白。它具有N－糖苷酶活性，可以灭活真核细胞的核糖体，使其蛋白质的生成受阻，从而导致细胞死亡［1］。具体来说，RIPs因其具有N－糖苷酶活性，能够作用于真核生物28S核糖体RNA大亚基上的茎环节构顶部GA4324GA的普遍保守的S／R区域，通过脱嘌呤作用，阻滞了延长因子EF－2与核糖体的结合，使细胞内核糖体失活，从而不可逆地抑制蛋白质合成［2］，进而引发细胞凋亡或坏死。RIPs还具有RNA水解酶活性，可以裂解28SRNA的第4 325与4 326位核苷酸之间的磷酸二酯键［3－4］。

RIPs的发现距今已有一百多年的历史，它是植物产生的一种具有防御和保护自我功能的蛋白质［5－7］。RIPs可存在于植物的各个部位，以种子中的含量最高［8］，并且，不同植物种子中RIPs含量也不同。目前，也有人在某些真菌（如蘑菇）、藻类和细菌（如志贺毒素）中发现RIPs［9－11］，它们可以抑制蛋白质合成，但作用机制和植物RIPs并不是完全相同［12］。起初发现它们具有共同的RIPs毒性机制，可以抑制真核细胞核糖体蛋白质生物合成，随后发现它们还具有抗病毒、抗细菌、抗增殖、抗肿瘤、抗艾滋病病毒、抗孕及神经毒性等多方面的作用，因此，先后引起农业领域、生物及医学界的广泛关注。

1 核糖体失活蛋白的分类及其生物学活性

目前，依照RIPs结构的不同，可分为3类（或3型）［13］:一型RIPs为单肽链碱性蛋白，相对分子质量为30×103左右，具有RNA N－糖苷酶活性。包凌等［14］研究发现，一型RIPs一级结构有很高的同源性，二级结构有较多的α－螺旋和β－折叠，它们具有相似的生物学活性。科研人员还从一些葫芦的种子中分离提纯出一些相对分子质量为10×103甚至更小的RIPs，它们的特点是含有丰富的精氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺残基［15］。一型RIPs的单链即为具有灭活核糖体功能的活性链，具有N－糖苷酶活性，它与细胞膜上磷脂相互作用，通过受体介导的内吞作用进入细胞，但内化效率不高，因此，细胞毒性较小。此外这类RIPs进入细胞的机制还涉及受体非依赖性机制［16］。

二型RIPs为异源二聚体酸性蛋白，分为A、B两条肽链，通过二硫键相连，并具有强烈的疏水作用，相对分子质量为60×103左右。A链与一型RIPs相似，具有RNA N－糖苷酶活性；B链对半乳糖结构具有特定的凝集素活性，能与细胞表面的糖基相互作用，从而帮助A链进入细胞发挥毒性功能。还有一些二型RIPs由4条多肽链组成，实际上是由两个相同的双链RIPs分子通过次级键结合在一起的二聚体，其性质与双链RIPs相同，但毒性相差甚远。最新研究发现，B链除了诱导凋亡或坏死的作用外，还具有诱导破骨细胞分化的功能。这项研究成果，为破骨细胞分化的调节和骨骼免疫学的研究提供了新的方向［17］。

三型RIPs比较少见，也是一类单链蛋白，包括一个与一型RIPs相似的N端区域和一个未知功能的C端区域［18］。其先通过合成无活性的前体，然后在涉及形成活性位点的氨基酸之间进行酶解加工才形成成熟RIPs［19］。三型RIPs合成时以无活性的蛋白前体形式存在，当活性位点氨基酸中间的二硫键以及C末端和N末端的扩展序列被水解之后，三型核糖体才具有活性。

2 RIPs的应用

2.1 抗孕 一型RIPs中的中药天花粉蛋白（TCS），是传统中医认可的堕胎药。研究发现，TCS是通过杀死绒毛滋养层细胞使胎儿致死。绒毛滋养层细胞对TCS非常敏感，实验发现绒毛滋养层细胞摄入大量的TCS分子后，导致绒毛广泛变性坏死，纤维素沉着，绒毛间隙闭塞及血循环受到阻断，血循环的阻断又加速绒毛的变性坏死，促使前列腺素释放而流产。

2.2 抗肿瘤 早在1970年，Lin等［20］就已研究发现蓖麻毒素ricin和相思子毒素abrin对小鼠腹水瘤、Yoshida肉瘤、实验性白血病、B16黑色素瘤有治疗作用。通过临床观察及实验室证明，TCS可直接作用于绒毛滋养叶细胞，使之变性坏死并可提高机体的免疫功能，从而提出TCS可作为治疗恶性滋养叶肿瘤的选用药物之一。有研究结果表明，TCS对T淋巴细胞和巨噬细胞衍生的细胞株的杀伤作用主要是通过诱导细胞凋亡实现的，提示TCS的抗肿瘤细胞作用与细胞类型相关的，并且针对不同类型的细胞有其不同的机制。最近有研究显示，分离纯化的蓖麻种子毒蛋白，是具有杀死食管癌细胞的一类RIPs，是稳定剂型的蛋白质药物。

但由于RIPs具有很强的免疫原性，可诱导产生破坏性抗体IgG和IgE，产生一些如过敏反应、神经和肾脏毒性等不良反应，限制了临床应用。后来，免疫毒素的成功研制，为其在临床的应用开辟了新的领域，也成为现在医学界的研究热点。免疫毒素是抗体与毒素的偶联物，能更好地提高毒素作用的靶向性，从而更有效地发挥毒素的杀伤效应。其对肿瘤细胞的活性比游离毒素强，一般具有更高的疗效和更低的毒性。

2.3 神经科学方面的研究成果及应用 1982年，首先报道于远端迷走神经和舌下神经内注射蓖麻毒素，该毒素沿神经向神经元细胞传输，使核糖体失活，不可逆地抑制蛋白质合成，导致神经元死亡。这种毒素逆向轴浆运输的作用，造成神经系统的选择性损伤，称为“自杀性传输”。它们还可以结合单克隆抗体，治成免疫毒素，对特异性的神经元有选择性的杀伤作用，并被命名为“分子神经外科”。随后发现多种RIPs都具有类似神经毒性，如相思豆毒素、蒴莲根毒素等。一个细胞里大约有10%的核糖体失活，就可以杀死这个细胞。自杀性运输这种方法多用于实验用途，如决定神经介质的细胞定位、研究在严格限制范围内神经元丢失后感觉传到通路和运动系统的可塑性变化、评估初级感觉神经元在自噬行为中的作用等。

由于二型RIPs如蓖麻毒素具有凝集素B链，其毒性大，对细胞的选择性小。而一型RIPs为单链活性链，其细胞毒性就受到了很大的限制。Sha等［21］对两个结构相似的单链RIPs中药天花粉蛋白TCS和蓖麻毒素A链RTA的神经毒性进行研究后提出，这两种单链RIPs对小鼠视网膜神经细胞都具有毒性，引起小鼠视网膜明显改变。不同的是，TCS通过凋亡杀死特定部位的视网膜细胞（主要在外核层和内核层），而RTA引起视网膜发炎，导致细胞坏死。同时发现RTA的作用机制和二型RIPs中RCA的作用机制相同，说明二型RIPs的B链在神经毒性方面可能并不是很必要的。通过这个研究结果提示RIPs可以应用于视网膜模型的创立，TCS可能可以用于视网膜母细胞瘤的化疗。

香港中文大学的研究人员还进行了对TCS周围性神经毒性的实验研究，发现TCS通过周围神经轴突逆向运输，在相应节段的脊髓前角运动神经元几乎全部死亡而相应节段的背根神经节的感觉神经元仅部分死亡，显示出TCS对感觉神经元具有选择性神经毒性。因此，TCS可以用来诱导神经损害，可能可以用于治疗慢性痉挛、痛觉过敏和疼痛等的治疗。

2010年，Sha等［22］进一步研究了TCS引起的视网膜神经毒性在细胞通路、神经胶质细胞反应等方面的机制。研究显示TCS主要通过线粒体退化路径来诱发凋亡，TCS可以选择性地进入视网膜的穆勒胶质细胞和色素细胞，可以引起神经胶质细胞类型和数量的变化，随后导致光感细胞死亡。相反的，RTA可以进入血管内皮细胞并破坏血管内皮，导致视网膜炎症和坏死，更进一步地揭示了TCS对神经系统的毒性机制，提示笔者可以利用RIPs特异性地杀死某些神经，从而减轻这些神经带来的伤害，如顽固性头痛，从而为临床上难治性神经系统疾病的治疗提供了新的思路。

3 核糖体失活蛋白的检测

与一型RIPs相比，二型RIPs由于B链的凝集素活性，便于进入细胞，产生较强的细胞毒性，在人们的日常生活中，应提高对RIPs作为毒物的认识。如蓖麻毒素毒性极强，为有机磷神经毒素的380倍，氰化物的6 000倍。基于其潜在的威胁，如今已根据RIPs的理化性质和免疫学特性研制出多种快速、灵敏、准确的检测方法，主要包括免疫荧光技术、夹心免疫PCR技术、免疫胶体金标记技术、蛋白芯片技术和生物传感器技术等，用于检测RIPs。有研究表明，纳米颗粒探针也能够用于蓖麻毒素等RIPs的检测，为人们的生命、生活及食品卫生安全提供多方面的保障。

此外，RIPs的检测手段的应用并不局限于军事防恐、食品卫生方面。有学者发明了应用酶联免疫吸附法测定麻风树核糖体失活蛋白的方法，为麻风树的综合利用提供了技术支持。从而在资源紧缺的今天，使大家可以综合利用资源，最大可能地少浪费。

4 展 望

综上所述，RIPs来源广，易获得。在生物医学界具有抗增殖、抗肿瘤、抗病毒、抗孕、免疫调节及神经系统毒性作用，具有重要的理论和应用价值。RIPs抗孕、抗肿瘤方面作用，结合更多、更高效的免疫毒素的研制，将会给人类带来意想不到的收获。使人们在进行药物流产时更安全、更有针对性、效果更好，不良反应更小。RIPs在神经系统方面的特性，给神经科学研究提供了更好的研究手段。TCS的选择性神经毒性作用有望在难治性神经系统疾病方面得到应用。

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10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.040

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1671－8348（2012）34－3663－03

国家自然科学基金面上项目（81171154）；深圳市基础研究计划资助项目（JCYJ20120613113228732）。 △

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2012－08－22）

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