某地区哈萨克族肥胖儿童ApoE基因多态性研究＊

张季红，王晓英，徐佩茹△，常忠生

（1.新疆医科大学第一附属医院儿科，乌鲁木齐830011；2.新疆维吾尔自治区人民医院儿科，乌鲁木齐830002）

某地区哈萨克族肥胖儿童ApoE基因多态性研究＊

张季红1，王晓英2，徐佩茹1△，常忠生1

（1.新疆医科大学第一附属医院儿科，乌鲁木齐830011；2.新疆维吾尔自治区人民医院儿科，乌鲁木齐830002）

目的探讨乌鲁木齐周边地区哈萨克族儿童肥胖与载脂蛋白E（ApoE）基因多态性的关系。方法 选择98例超质量／肥胖哈萨克族儿童（病例组）及88例健康者（对照组），采用聚合酶链反应－限制性片断长度多态性分析（PCR－RFLP）方法测定ApoE基因型及等位基因频率。结果（1）病例组与对照组的基因型频率ε3／3、ε2／3、ε4／4、ε2／2和ε3／4基因型分布差异无统计学意义（P＞0.05）。病例组和对照组ApoEε4等位基因频率分别为6.12%和2.87%，差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）病例组和对照组女性ApoEε4等位基因频率分别为7.44%和1.09%，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论ApoEε4等位基因是哈萨克族肥胖的危险因素，尤在女性儿童肥胖的发病中起重要作用。

肥胖；载脂蛋白E类；多态现象，遗传；哈萨克族儿童

近年来，儿童肥胖发病率正逐年升高，已成为全球关注的主要健康问题。在新疆地区进行的肥胖儿童调查显示，6～16岁维吾尔族、哈萨克族、汉族和回族4个民族儿童肥胖总患病率为5.66%。而哈萨克族位居新疆不同民族学龄儿童肥胖患病率之首，为8.94%［1］。载脂蛋白（apolipoprotein，Apo）E包含3个等位基因（ε2、ε3、ε4）和6种常见的基因表型（ε2／2、ε3／3、ε4／4、ε2／3、ε2／4、ε3／4），是一种由遗传决定的具有多态性的蛋白质，其中Apo E4等位基因是动脉粥样硬化的危险因素之一，据研究可能是冠状动脉粥样硬化性心脏病的重要遗传标记［3］。哈萨克族儿童肥胖发病率较高，但目前对哈萨克族儿童ApoE基因多态性的研究极少。为探讨哈萨克族单纯性肥胖儿童中ApoE基因变异与肥胖的关系，本研究采用聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性分析（PCR－RELP）方法对新疆地区186名哈萨克族超质量／肥胖儿童和非肥胖儿童ApoE基因型变异及等位基因频率的差异进行了初步研究，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集新疆乌鲁木齐市周边城市数所哈萨克族小学校进行健康普查，进行随机整群抽样，并且排除其他疾病导致的肥胖。体质量参照人群采用中国城区0～18岁男、女儿童身高、体质量值为参照［4］，体质量超过平均标准的15%为超质量，超过20%为肥胖，超过20%～29%者为轻度肥胖，超过30%～49%为中度肥胖，重度肥胖为超过50%者。病例组（超质量／肥胖儿童）98例，其中男51例，女47例，年龄为6～12岁；对照组为同区小学校哈萨克族非肥胖儿童，年龄性别与肥胖组基本配对，体质量不超过标准体质量的10%，共88例，年龄6～12岁，其中男44例，女44例。所有研究对象均征得家长同意并签字，同时经过本医院伦理委员会的批准。研究对象禁食12h后，抽取外周静脉血5mL，加到含2%乙二胺四乙酸二钾（EDTA－K2）抗凝管中，混匀，经8 000r／min离心后，小心吸取上清液留取作生化检测，其余－20℃冻存。

1.2 方法

1.2.1 体格测量 由专业培训过的人员用校正的身高、体质量计测量，受试儿童免冠、脱鞋测量立式身高。身高精确至0.1 cm。测量体质量清晨空腹仅穿短内裤测量，体质量精确至0.1 kg。计算体质量指数（BMI）＝体质量（kg）／身高2（m2）。

1.2.2 血清的采集和制备 晨起抽取空腹静脉血2mL，静置后以3 000r／min离心15min，上清液制备血清。并贮于－20℃备用。

1.2.3 基因组DNA的制备 静脉血2mL，经EDTA抗凝，淋巴细胞分离液分离白细胞后，传统酚氯仿法抽提DNA。

1.2.4 ApoE基因的PCR扩增及酶切消化 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。引物按文献［5］设计，上游引物序列为5′－AGA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC－3′，下 游 引 物 序 列 为 5′－TAA GCT TGG CAG GCT GTC CAA GGA－3′。PCR反应体系为30μL，内容如下:（1）3μL DNA模板；（2）10×PCR反应缓冲液3μL（不含 Mg2＋）；（3）2mmol／L dNTP 0.45μL；（4）3μL 二甲基亚砜（DMSO），25mmol／L MgCl22.2μL；（5）10μmmol／L上游引物1.5μL；（6）下游引物1.5μL；（7）去离子水15.2μL，（8）Tag DNA聚合酶0.75U。PCR的反应条件为:先行95℃预变性5min，继而95℃变性1 min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环后，72℃继续延伸10min，终末降至4℃。所得PCR产物，加限制性内切酶HhaⅠ于37℃水浴中过夜，充分酶切消化，采用5%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，后紫外灯下摄像。

表1 健康儿童与超质量／肥胖儿童ApoE基因型和等位基因频率分布比较

表2 不同性别超质量／肥胖组和对照组ApoE基因型和等位基因频率分布比较

1.3 主要仪器与试剂 采用 Mettler Toledo LD202电子天平、Beckman L8－55型超速离心机、DYY－6C型电泳仪、日本SanYo MDF－U52V超低温冰箱、DK－8A快速恒温数显水箱、DYCP－31DN型水平电泳槽、BIO－RAD Gel DOC 2000凝胶成像仪、PCR热循环仪为BIO－RAD公司产品；所用试剂蛋白酶K、dNTP、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶HhaⅠ均为上海生工生物工程公司产品。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件分析，吻合度检验确定符合Hardy－Weinber平衡定律，组间比较用χ2检验，检验水准α＝0.05（双侧），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肥胖组与对照组ApoE基因型和等位基因频率分布比较除ε2／4基因型未鉴别到外，ε3／3基因型频率在超质量／肥胖组和对照组中最高，ε3／4和ε2／3基因型频率次之，ε4／4和ε2／2基因型最少。而在超质量／肥胖组中，ε3／3基因型频率为85.65%，略低于对照组的89.88%，差异无统计学意义（P＞0.05）；超质量／肥胖组ε3／4基因型频率为8.16%，对照组为5.62%，差异无统计学意义（P＞0.05）；超质量／肥胖组ε3／2基因型频率为3.06%，对照组为2.24%，差异无统计学意义（P＞0.05）。 超 质 量／肥 胖 组 ApoEε4 等 位 基 因 频 率 为6.12%，高于对照组的2.87%，差异有统计学意义（χ2＝41.27，P＜0.05），两组 ApoEε3和 ApoEε2等位基因频率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 肥胖组与对照组不同性别ApoE基因型和等位基因频率分布比较 超质量／肥胖组和对照组ε3／3、ε2／3和ε3／4基因型在男、女不同性别中的频率分布差异无统计学意义。超质量／肥胖组女性和对照组女性ApoEε4等位基因频率分布分别为7.44%和1.09%，差异有统计学意义（χ2＝4.569，P＜0.05），而在男性两组无明显差异。超质量／肥胖组和对照组ApoEε2和ApoEε3等位基因频率在不同性别间的比较，差异亦无统计学意义，见表2。

图1 ApoE基因突变电泳结果

3 讨 论

ApoE基因是位于第19号染色体长臂13区2带（19q13，2）上的有多态性改变的基因。其3个等位基因，ε2、ε3和ε4，可产生ε2／2、ε2／3、ε3／3、ε4／4、ε2／4、ε3／4共6种基因型，即有对应的ApoE 2／2、ApoE 2／3、ApoE 3／3、ApoE 4／4、ApoE 2／4、ApoE 3／4 6种遗传表现型［5］。

本研究显示，乌鲁木齐周边地区哈萨克族儿童中存在ApoE基因型及等位基因频率的差异，其中ε3／3基因型发生频率最高，ε2／2基因型发生频率最低，而ε2／4基因型未检出。本实验发现，ApoE等位基因最常见为ε3、ε2等位基因发生频率最低，与国内外报道相一致。ApoEε4等位基因在肥胖组要明显高于对照组，在哈萨克族女性儿童中尤为显著，说明ApoE ε4等位基因是哈萨克族儿童肥胖的危险因素之一，尤其对哈萨克族女性肥胖儿童的发病起重要作用。

ApoE基因在调节血脂与脂蛋白代谢方面具有重要作用，故被认为是肥胖的重要候选基因之一［6］。近年研究表明，ApoE基因结构功能异常与高脂血症、动脉粥样硬化等疾病的有着密切的相关性。ε4等位基因是冠心病（chronic heart failure，CHD）的重要遗传标记，而ε2等位基因则对人体起保护作用［7］。本研究发现，哈萨克族超质量／肥胖儿童与非肥胖儿童比较，其ε4等位基因频率增高，差异有统计学意义（P＜0.05），提示哈萨克族肥胖儿童已存在促进CHD发生的危险因素，携带ε4等位基因的哈萨克族肥胖儿童成年后有患CHD的危险性。受检的哈萨克族儿童体质指数与成年后患CHD是否有相关性，以及与ApoE基因多态性的关系还有待进一步研究。

有研究表明，ApoE基因多态性与血脂的代谢水平相关［8］。ε4等位基因作为CHD的遗传易患因子，可能引起高胆固醇血症，在单纯性肥胖儿童中ε4明显增高。本研究发现，哈萨克族超质量／肥胖儿童ApoE基因ε4等位基因频率高于非肥胖儿童，哈萨克族肥胖儿童发生机制可能与脂代谢紊乱有关，ApoE基因多态性可能通过影响血脂水平，从而增加哈萨克族成年人患CHD的风险。已有研究表明，单纯性肥胖儿童较非肥胖儿童发生CHD的年龄更早，因此，从基因角度分析，哈萨克族儿童肥胖发病率高于其他民族的因素，尽管是多因素的，与饮食和环境有关，但还具有遗传易感性，哈萨克族肥胖儿童成年后患心血管疾病的风险高于其他民族。因此，为了预防哈萨克族CHD的发生，应从儿童开始注重对危险因素的评估。通过及早进行基因型检测，早期发现高危人群，以便及时进行干预治疗，这对哈萨克族整体人群健康具有重要的临床意义。

［1］徐佩茹，张卫平，阿依古丽，等.新疆地区不同民族学龄儿童肥胖患病率及相关因素分析［J］.中华现代医学杂志，2003，3（1／2）:107－109.

［2］Davignon J，Gregg RE，Sing CF.Apolipoprotein E polymorphism and athosclerosis［J］.Arteriosclerosis，1988，8（1）:1－21.

［3］Peter WF，Richard H，Martin G，et al.Apolipoprotein E alleles，dyslipdemia and coronary heart disease［J］.JAMA，1994，272:1666－1671.

［4］吴瑞萍，胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学［M］.北京:人民卫生出版社，1997:567－569.

［5］王莲，刘长云，赵园园，等.单纯性肥胖儿童脂代谢与LEPR及ApoE基因多态性的相关性研究［J］.中华妇幼临床医学杂志，2007，3（4）:189－193.

［6］蔡建光，印大中.阿尔茨海默病主要相关基因及其功能蛋白研究进展［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2006，13（2）:120－124.

［7］Bonithon－Kopp C，Touboul PJ，Berr C，et al.Relation of intima－media thickness to atherosclerotic plaques in cortid arteries.The Vascular Aging（EVA）study［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1996，16（2）:310－316.

［8］肖志杰，赵水平，聂赛，等.载脂蛋白E基因多态性对血脂的影响［J］.中华流行病学杂志，2005，26（7）:533－536.

The study of Apolipoprotein E gene polymorphism with obesity in Karzak children in an area＊

Zhang Jihong1，Wang Xiaoying2，Xu Peiru1△，Chang Zhongsheng1
（1.Department of Paediatrics，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi，Xingjiang830011，China；2.Department of Paediatrics，Xinjiang Uygur Autonomous Region People′s Hospital，Urumqi，Xingjiang830002，China）

ObjectiveTo study the relevance of Apolipoprotein E gene polymorphism and obesity in Xinjiang Karzak children.MethodsUsing polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism（PCR RFLP），to determine the apolipoprotein E genetypes and allele frequency in 98cases of patients with obesity，and 88cases of normal control.Results（1）there were not difference amongε3／3，ε2／3，ε4／4，ε2／2andε3／4genetype from children with simple obesity and normal control.The allele frequency of ApoEε4was higher in obese group than that in normal control，6.12%and 2.87%（P＜0.05）.（2）ApoEε4allele frequency in female in obese group and normal control such as 7.44%and 1.09%，this difference also had statistically significance（P＜0.05）.ConclusionApoEε4allele frequency is a risk factor of Karzak children obesity.especially in femal obese Karzak children.

obesity；apolipoproteins E；polymorphism，genetic；Karzak child

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.004

A

1671－8348（2012）34－3586－02

新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目（200521116）。 △

，Tel:13009679209；E－mail:xupeiru126＠126.com。

2012－07－02

2012－09－18）

·临床研究·