温度对蛹虫草生长发育的影响

秦俊哲， 杜军国， 程 伟

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

蛹虫草(CordycepsmilitarisLink.)又称为北虫草、北冬虫夏草，隶属于真菌界的子囊菌门(Ascomycota)、核菌纲(Pyrenomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)，为虫草属(Cordyceps)的模式种[1]，是世界性的广布种.含有丰富的虫草菌素、多糖类(半乳糖、甘露醇聚糖)、虫草酸、核苷类(腺苷、尿苷、鸟苷)及多种氨基酸活性物质[2,3]，具有滋肺增精补肾、止血化痰、抑制肿瘤、止咳镇静、驱风、散热、驻容美颜、延缓衰老、提高机体免疫力之功效，它与冬虫夏草同属不同种，同样享有珍惜名贵药材之誉.我国自20世纪80年代在吉林省蚕业科学研究所人工培养蛹虫草试验成功以来[4]，虽然方法不断改进，但由于影响蛹虫草人工栽培的因素很多，其人工栽培技术至今在我国未得到有效的推广应用.究其原因，除了其分化发育机理及遗传学[5-9]基础尚不清楚外，自身种类多、分布比较广泛、菌种容易退化、栽培环境的不易掌控等也直接影响了蛹虫草大规模的产业化.本试验拟就温度对蛹虫草生长的影响规律进行系统研究, 以期为蛹虫草子座的产业化生产的环境控制提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料与设备

1.1.1 菌种

供试的蛹虫草菌种CM1和CM2采自西安宏生虫草专业合作社，经由陕西科技大学微生物实验室分离并经子座分化实验后备用；CDM-003由西北农林科技大学微生物教研室提供.

1.1.2 原料

主要原料包括小麦、葡萄糖、蛋白胨、蚕蛹粉、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B1.

1.1.3 仪器

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗器械厂) , SW -CJ-1F 超净工作台( 苏州净化设备有限公司) , MJ-160型霉菌培养箱，HYG-IIa迴转式恒温调速摇瓶柜(上海欣蕊自动化设备有限公司)，其他为一般常规设备工具.

1.1.4 培养基

在栽培容器( 400 mL罐头瓶) 中，加入28 g小麦+2 g蚕蛹粉+45 mL的营养液.其中，营养液配方：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5 g，硫酸镁(MgSO4) 0.5 g，VB12片，水1 000 mL，pH 自然.培养基配制：混合均匀，置于高压蒸汽灭菌锅内121 ℃下灭菌60～80 min，冷却后备用.

1.1.5 菌种活化

将试验菌种接入PDA培养基中, 置于25 ℃恒温生化培养箱中培养7～10 d，菌丝长满斜面，将活化菌种接入120 mL/250 mL锥形瓶中(葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.05%，VB10.05%)，在 25 ℃、160 r/ min 摇床震荡培养，制备液体菌种备用.

1.2 试验方法

培养基装入培养瓶中灭菌后冷凝，每瓶用无菌注射器接种菌液5 mL.将菌丝从接种到子座成熟分为发菌、转色、子座分化和子座生长等4个阶段，除试验阶段在不同的温度(16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃)下培养外，其余阶段培养温度均为23 ℃，光照用灯为荧光灯，空气湿度控制在80%～90%.观察并记录菌体生长情况.

2 结果与分析

2.1 温度对发菌的影响

由表1可知，当温度为24 ℃时，CM1、CM2、CDM-003发菌所需的时间分别为30 h、30 h、24 h，比16 ℃时的发菌时间分别要低10 h、6 h、12 h，表明24 ℃时最有利于菌种的发菌.在20～28 ℃时，菌丝铺满培养瓶表面所需的时间为8～10 d，菌丝的长势(密度、色泽等)也较好.此时，3种不同的菌株间的表现差异也不大.但在16 ℃时，铺瓶时间分别为13 d、13 d、10 d，延长了2～4 d，此时菌丝的长势较为稀疏，表明低温不利于缩短生产周期.表1也同时表明，20～28 ℃应为菌丝生长的最适温度，但在20 ℃时，子座的鲜产量相较与24 ℃和28 ℃时却为最大，平均多产2～5 g，表明虽然生长的最适温度是指生长最快的温度，但这并不是菌株生长最健壮的温度.因为在最适温度下，菌丝体内的有机物消耗过多，子座反倒长得细长柔弱.因此在生产实践上培育健壮菌株，温度常常应低于最适温度.因此，在生产实践中，选取20 ℃时发菌，有利于获得最大子座鲜重.

表1 温度对菌丝体生长的影响

2.2 温度对菌丝转色的影响

随着时间的推移，生理成熟的蛹虫草菌丝体最初可在料面、料与容器间隙聚集扭结成肉眼隐约可见似蚕卵的团状物，这种团状物为原基的前身，即菌丝团[6].菌丝团颜色一般同其着生处菌丝体颜色一致，呈橙黄、橙色或橙红色，这一阶段也称为转色阶段.实验结果如表2所示，不同的温度对CM1、CM2完成转色所需的时间及色泽、转色状况等影响不大，但却对CDM-003有显著的影响，16 ℃和28 ℃的温度下，其转色状况为差和很差.表2也同时表明，20 ℃时不同的菌株均能获得较大的子座鲜重.

表2 温度对菌丝转色的影响

图1 20 ℃时CM1、CM2、CDM-003菌株的转色情况

2.3 温度对子座分化的影响

待菌丝完全转色后，菌丝团内部组织分化，则变成较坚实的小刺尖状，即小原基，原基的形成对子座的生成至关重要，因此，考虑到其生长的原生态环境，可通过8～10 ℃的温差刺激原基的形成.原基的颜色同着生处的菌丝体颜色一致.小原基经继续培养，即逐渐膨大，并开始组织分化，长成顶端上呈白色、顶端下呈橙黄色或橙色、橙红色的尖锥状的小子座.实验结果表明，在20 ℃时的子座分化情况最好,如图2所示.

图2 20 ℃时CM1、CM2、CDM-003菌株的子座分化情况

2.4 温度对子座生长和子实体生成的影响

小子座经培养后变粗伸长，顶端白色消失，从而进入子座正常稳定的成长阶段. 进入正常稳定生长阶段的子座，在其培养后期一般就不再增粗伸长，头部膨大呈棒形，顶端呈钝圆或扁圆形，也有呈叶尖形的.子座的上部略小，呈长圆柱形或扁圆形，有的柄中间具明显纵陷纹，全株呈橙色或橙红色.进入成熟阶段的子座，其柄一般不再增粗伸长，有些由于包裹在其内的子囊壳伸长顶端外露的缘故，顶端出现乳头状小突起，还有些，由于弹射孢子缘故，在其背部会呈现龟背状花纹.至此子座完全成熟，其形状、颜色与成长阶段基本相同.实验结果如表3所示.

表3 温度对子座生长和子实体生成的影响

由表3可以看出，蛹虫草子座生长温度为 28℃ 时, 子座成熟很快, 一般 48～ 57 d 就可采收, 但子座短小、多畸变，平均株高与20 ℃时相比下降了1.2～1.7 cm，子座鲜重下降了5～6 g，商品性也差；当生长温度为 20～24 ℃时，子座生长适度, 可维持生长期 56～ 68 d, 形成的子座粗而长, 产量高, 商品性好.当温度低于20 ℃时，子座不易形成子囊孢子，推迟了成熟时间，延长了子囊座的生长期，增加了成本，在工业化生产中不利于降低生产成本.表3还表明，CDM-003成熟所需的时间明显低于CM1和CM2，但是其每瓶子座的鲜重也略低于后两者，猜想认为是由种间差异所致.

图3 24 ℃时CM1、CM2、CDM-003菌株的子座生成情况

3 结论

蛹虫草属于中偏低温、变温结实型真菌, 高温不利于蛹虫草的生长繁殖.因此，在人工培养蛹虫草子实体时，根据蛹虫草对温度的要求，可分春、秋两季栽培.适宜的播种时间由两个条件决定：一是接种期在当地旬平均气温不超过24 ℃；二是从接种时往后推1个月为子座分化期，当地旬平均气温不低于16 ℃.春季一般安排在3月上旬种植，秋季在10月上旬完成.立秋过后，气温由高转低，昼夜温差过大，正好有利于子座分化，是栽培的最佳季节.在进行工厂化连续生产时必须有良好的温度控制措施.

本研究结果表明，蛹虫草菌丝生长对温度十分敏感，即微小的温度变化就会引起较大的生理效应.从实验可知，蛹虫草菌丝发菌的最佳温度为20 ℃.但从蛹虫草菌丝长势来看，20～ 24 ℃培养的菌丝长势最好，气生菌丝旺盛、浓密、洁白、易于转色.因为在生长温度较低时, 菌丝的生长速率虽有所降低，但分枝较多，单位栽培料中的菌丝量增加，生长旺盛，对提高后期子座产量十分有利.但当温度过低时，发菌期较长，对设备的利用率有一定影响.因此在进行蛹虫草工厂化栽培时, 要合理调节菌丝体培养温度, 在不影响产量的前提下, 尽量缩短生产周期, 提高经济效益.

蛹虫草菌丝转色的最适温度为20 ℃, 高温和低温都不利于转色.一般情况下，转色后的菌体，都能分化子座，但有些原因也造成转色后的菌体不能形成正常子实体，表现为：①料面不分化原基，仅在菌体周围贴瓶形成不规则的爬璧菌索.②原基分化密集，相互粘连，继而形成厚而坚实的菌丝组合体，不形成正常子座.③子座分化稀疏，呈线状倒伏，或子实体短小纺锤形.形成这些的原因可能是：①栽培季节选择不当，菌体转色后遇连续低温或高温的环境条件，使成熟的菌体转入生殖生长后，在高于或低于原基分化温度的情况下，由于基内营养的不断输送供给，而在表层形成坚硬的菌核，在周围形成爬璧菌索.②使用劣质菌种，种性较差.因此在进行规模化生产时, 一定要控制好菌丝转色温度和选择优良的菌种.在生产中, 菌种的质量也是影响转色的重要因素, 优良的菌种只要温度适宜都能转色，但转色时间和转色效果是影响蛹虫草子座产量的关键, 与子座分化的数量和时间有很大关系.适时转色的蛹虫草，子座形成早、数量多、产量高，反之子座形成时间推迟、数量少、产量低.转色困难的菌种一般难以形成子座，即使能形成子座产量也很低.综上所述，蛹虫草对温度比较敏感，不同的生长阶段对温度要求不同，在生产中适宜于分阶段变温管理.

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