Plackett-Burman法筛选保加利亚乳杆菌发酵培养基氮源

陈 合, 李串娜, 舒国伟

(陕西科技大学 生命科学与工程学院，陕西 西安 710021)

0 引言

保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus,LB) 为人体乳酸菌益生菌[1]，被广泛应用于食品发酵、乳酸饮料行业、饲料行业和医疗保健等领域[2].它能够调节人体胃肠道微生态平衡、促进消化吸收、增强免疫功能、抗癌抗肿瘤等重要的生理保健功能，因而受到越来越多消费者的喜爱和重视[3,4].

保加利亚乳杆菌是酸奶发酵常用的菌种之一[5]，在酸奶制作过程中，选择发酵剂极为重要.它直接影响酸奶的生产工艺过程及质量.因此要获得发酵活力优良的酸奶发酵剂，首先要培养高浓度乳酸菌，筛选出适合乳酸菌生长的增殖培养基，使乳酸菌得以大量增殖.

乳酸菌的生长营养要求比较复杂.需要添加多种促进因子，国内有许多对乳酸菌增殖培养基进行优化的报道[6-8]，多数是在MRS 培养基的基础上添加一些优化因子.MRS培养基是实验室常用的培养基，但其成本复杂、价格昂贵、制备繁琐，不适合高效浓缩型发酵剂的工业化生产[9].

Plackett-Burman(PB)设计法是一种两水平的试验设计方法.该方法用最少的试验次数达到对因素的主效应尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，以供进一步的研究[10].PB试验设计目前已经广泛应用于生物工艺的优化中，如乳酸生产[11]、益生菌生长主要影响因子的筛选[12]、杯伞菌产胞外多糖主要因子的筛选[13]、产α-葡萄糖苷酶抑制剂主要因子的筛选[14]等.另外，该方法还具有数据处理简单，适用于任意多个实验因子的优点.

本研究以保加利亚乳杆菌为出发菌株，以廉价易得的原料作为基础培养基，通过PB实验设计优化筛选出对其生长影响较为显著的几种氮源，为工业化大规模生产浓缩型发酵剂提供理论基础和参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

保加利亚乳杆菌，实验室提供.

1.1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：胰蛋白胨，酪蛋白水解物，大豆蛋白胨，新生牛血清及以下培养基中所用试剂均为生化试剂级.

仪器：SW-CJ-1F 无菌操作台，苏州净化；DH5000AB 电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；手提式蒸汽压力灭菌器，江阴滨江医疗器械厂；722 型光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂；PHS-3C 型酸度计，上海精科仪器公司；电热鼓风干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司.

1.1.3 培养基

(1)MRS培养基(g/100 mL)：葡萄糖2 g，蛋白胨1 g，牛肉膏0.8 g，酵母浸粉0.4 g，柠檬酸二铵0.2 g，磷酸氢二钾0.2 g，乙酸钠0.5 g，MgSO40.02 g，MnSO40.004 g，吐温-80 0.1 mL.用于菌种的活化和计数.

(2)发酵基础培养基(g/100 mL)：葡萄糖5.43 g，蛋白胨1 g，磷酸氢二钾0.6 g.用于菌种的培养.

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

菌种活化→基础培养基培养(不同氮源的选择)→调节pH→液体培养→取样制平板→活菌计数.

1.2.2 菌种活化方法

MRS培养基经118 ℃灭菌15 min备用，然后将LB以2%的接种量接种于MRS培养基中，37 ℃恒温培养18 h，取出后于4 ℃冰箱保存.

1.2.3 培养方法

LB经MRS培养基传代活化至活力恢复后，以3%(V/V)接种量接入发酵培养基中，35 ℃静置培养20 h后，测定增菌液的OD、pH及活菌数.

1.2.4 Plackett-Burman试验设计方法

根据有关文献记载及本课题组前期对保加利亚乳杆菌的研究，采用Plackett-Burman试验设计从氮源 (蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、酪蛋白水解物、大豆蛋白胨及新生牛血清)中筛选出对LB增殖比较明显的三种.本文中所有PB 试验设计、数据分析及模型建立等皆由统计软件SAS9.1 辅助完成.

1.3 测定方法

1.3.1 菌体形态观察

采用甲苯胺蓝染色法：涂片固定后，滴加0.2%的甲苯胺蓝染色液，染色2 min后水洗，然后用1%的乙酸脱色1～2 s 后用水冲去，并用滤纸吸干多余水分后镜检.

1.3.2 OD值及pH值测定

吸光度(OD值)测定：用722S型可见分光光度计，在600 nm处进行测定.同时，以空白培养基作为对照.

pH测定：采用pHS-3C型pH计测定发酵液的pH值.

1.3.3 活菌数测定

通过梯度稀释法，在超净工作台中将增菌液适当稀释，选择合适的稀释度，取0.1 mL接种于经灭菌后且冷却至45～50 ℃左右的MRS 固体平板培养基上，于37 ℃培养48 h，选30～300个之间的菌落数进行活菌计数，每个稀释度做三个求均值，结果以108cfu/mlL报告菌体浓度.

2 结果与分析

2.1 PB试验结果

实验采用次数N=12的试验设计，对蛋白胨(X1)、酵母粉(X2)、牛肉膏(X3)、胰蛋白胨(X4)、酪蛋白水解物(X6)、大豆蛋白胨(X7)、新生牛血清(X8)等8个因素进行考察，其中(X5)为虚拟因素.分别对应于表中的8列，效应值为活菌数(Y).每个因素取2个水平，对每个因子取高低2水平进行分析，低水平为原始培养条件，高水平约取低水平的2倍，培养 48 h 后进行菌落计数，试验设计和结果见表1和表2.从表2可以看出，当OD值较高，达1.195时，活菌数也比较高，达到44.4×108cfu/mL.

表1 实验因素的编码水平表

表2 Plackett-Burman试验设计及结果

2.2 PB试验结果分析

在试验设计时，8个因素中包含有1个空白项，其作用是减少试验误差.利用统计软件SAS9.1分析试验结果，各氮源对LB的促进程度由p值确定，选择p值较小的因素为重要因素.试验结果分析，得各因素的p值见表3.

表3 Plackett-Burman设计试验结果方差分析

图1 各因子95%的置信区间图

方差分析的p值检验回归系数的显著性，p值越小越显著.由表3的分析结果可以看出， LB生长影响顺序：新生牛血清(X8)>酵母粉(X2)>酪蛋白水解物(X6)>蛋白胨(X1)>胰蛋白胨(X5)>大豆蛋白胨(X7)>牛肉膏(X3).由此可知，新生牛血清(X8)是影响LB生长的显著因子，酵母粉(X2)和酪蛋白水解物(X6)是影响LB的重要因子.其余因子影响不显著，虚拟因素对结果影响也不大，表明该结果可信.

图1也说明X8、X2、X6 对LB生长影响较大.并且，X8和X2对响应值Y(活菌数)呈负效应关系，X6对响应值Y呈正效应关系.即响应值Y随X8和X2浓度的增大而减小，随X6浓度的增大而增大.

3 结论

采用Plackett-Burman(PB)设计从众多考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素.本研究应用该方法快速筛选了对影响保加利亚乳杆菌增殖培养的氮源，既省时也可同时比较分析各因素之间的交互作用，保证了实验的精确性.

由PB实验设计结果可知，在7种氮源中，新生牛血清、酵母粉、酪蛋白水解物等3个因素对保加利亚乳杆菌的增殖比较明显，因此可选择这三种物质作为保加利亚乳杆菌的增殖因子.

[1] 张 刚.乳酸细菌: 基础、技术和应用[M].北京: 化学工业出版社,2007:212-266.

[2] Gardner N J, Savard T, Obermeier P,et al. Selection and characterization of mixed starter cultures for lactic acid fermentation of carrot, cabbage, beet and onion vegetable mixtures[J].International Journal of Food Microbiology, 2001, 64(3): 261-275.

[3] 徐子钧,李剑,梁凤来.利用 SAS 软件优化 L-乳酸发酵培养基.微生物通报,2004,31(3):85-87.

[4] 张和平,张列兵.现代乳品工业手册[M].北京:中国轻工业出版社, 2005.

[5] 申 彤,徐 静.植物原料乳酸菌发酵剂增菌培养的研究[J].食品科技,2006,31(9): 47- 49.

[6] 张建友,李艳武,赵群波,等.冻干乳酸菌菌种增殖培养基的优化[J].中国乳品工业,2002,30(5):40-43.

[7] 黄良昌,吕晓玲,姚秀玲.德氏乳杆菌保加利亚亚种浓缩培养的研究[J].中国乳品工业,2002,30(1):12-15.

[8] 田洪涛,贾英民,马雯,等.嗜热链球菌促生长物质研究及增殖培养基的优化筛选[J].食品科学,2002,23(5):60-62.

[9] 万红兵.高效浓缩型酸奶冻干发酵剂制备关键技术研究[D].保定:河北农业大学,2006.

[10] A Miller, R R Sitter.Using the folded-over 12-run plachett-burman design to consider interactions[J].Technometrics ,2001,43(1):44-54.

[11] Payot T, Chemaly Z, Fick M. Lactic acid production by Bacilluscoagulaus-kinetic studies andoptimization of culture medium for batch and continuous fermentations[J].Enzyme Microb Technol, 1999, 24(3/4):191-199.

[12] 杨承剑,黄兴国,李 伟,等.Plackett- Burman 设计在益生菌生长主要影响因子筛选中的应用[J].饲料工业,2007,28(16):31-33.

[13] 王允祥. 杯伞AS 5.112胞外多糖发酵、生物活性及结构分析[D].南京:南京农业大学,2004.

[14] 吕凤霞.α-葡萄糖苷酶抑制剂的产生菌筛选、性质及其发酵条件的研究[D].南京:南京农业大学,2003.