体外法筛选α-淀粉酶和糖化酶的最佳组合研究

由大鹏贾红梅黄慧敏刘艳玲

(1.通辽市农牧业局动物卫生监督所，内蒙古通辽028000；2.内蒙古医科大学基础医学院机能实验中心，内蒙古呼和浩特010010；3.乌兰察布市委党校，内蒙古集宁012000；4赤峰市林西县畜牧局，内蒙古林西025250)

酶制剂作为一种饲料添加剂，其能分解饲粮中的抗营养因子,提高饲料养分的消化吸收率已经被广大饲料生产企业所认同。但酶制剂作为一种应用条件很高的工业化产品，由于菌种、发酵底物及发酵条件等诸多差异导致其酶学质量参差不齐。体内法和体外法是评定酶制剂的两种方法，体内法受其周期长、繁琐、影响因素多的影响，而体外法所表现出的快速、重复性好、易操作的优势，成为酶制剂产品在投放市场之前进行快速有效的筛选和评定手段。

α-淀粉酶和糖化酶已被饲用酶制剂生产企业推广投放到市场，但应用体外法对这两种酶制剂的研究报道却十分鲜见。本试验应用体外法研究不同水平α-淀粉酶和糖化酶对玉米、小麦及全价日粮中的体外消化率，筛选出其在复配过程中的最适宜添加量组合，为家禽日粮中添加这两种酶提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 酶制剂

α-淀粉酶（2 000 IU/g）、糖化酶（150 000 IU/g），由肇庆市华芬饲料酶有限公司提供。

1.2 酶解样品

玉米（内蒙古土左旗）、小麦（内蒙古林西县）、0～3周龄肉鸡全价日粮，均过60目筛。

1.3 试验设计与分组

采用3×3两因子析因试验设计，添加量及分组情况见表1。

表1 试验设计及分组情况

1.4 离体模拟消化过程

离体消化试验参照文献[1-4]介绍的方法，并根据实际需要做了相应调整。

1.4.1 胃消化阶段

准确称取1 g（＜1 mm）饲料样品(精确至0.1 mg)，置于150 ml锥形瓶中，向锥形瓶中加入15 ml磷酸缓冲液（0.2 M，pH值6.0），小心混合均匀后，加入10 ml 0.2 M HCl溶液，将食糜pH值调至2.5（1 M HCl或1 M NaOH），并记录所加溶液体积（800 μl），然后加入胃蛋白酶溶液1.0 ml，再加入新鲜的糖化酶和淀粉酶的盐酸混合溶液2.0 ml（9个水平），调节pH值至2.5，并记录所加溶液体积（200 μl），用胶塞封口。将锥形瓶于40℃恒温水浴摇床中（120次/min），5 min后开始计时，消化4 h。

1.4.2 小肠消化阶段

待胃消化阶段结束后，向食糜中加入10 ml磷酸缓冲液(0.2 M、pH值6.8)和5 ml 0.6 M的NaOH溶液,调整食糜pH值至7.0,再加入新鲜的胰蛋白酶溶液1.0 ml,并使pH值仍保持6.8，记录所加溶液体积（μl）。用胶塞封口后，于40℃恒温水浴摇床中（120次/min），放入5 min后开始计时，继续消化4 h。

1.4.3 测定指标

1.4.3.1 还原糖生成量

消化结束后，将消化液冷却静置，取上清液离心后，再用移液管移取离心管消化液1.0 ml，并加入1.0 ml蒸馏水到相对应试管中，然后加入3.0 ml DNS试剂摇匀，在沸水中煮沸5 min，然后放入冰水浴中冷却以终止显色反应，540 nm下测定酶样吸光值(以等容无糖DNS试剂空白做对照)，折算出还原糖生成量。

1.4.3.2 干物质消化率和离体消化能

在消化残渣中加入12 ml磺基水杨酸(浓度10%),于室温放置30 min，最后将残渣连同己知重量的无氮滤纸置于105℃烘箱中烘至恒重，用能量测定仪Parr 1281测定能值，分别计算出干物质消化率和离体消化能。

1.5 数据分析

用SAS9.0软件进行二因素方差分析，并对各组多重比较（Duncan's法），观察显著性水平。

2 结果与分析

2.1 α-淀粉酶和糖化酶对还原糖生成量的影响(见表2)

表2 α-淀粉酶和糖化酶对还原糖生成量的影响(mg/g)

由表2可知：随着α-淀粉酶和糖化酶添加量的提高，3种原料组的还原糖生成量也相应出现不程度地增加(P＜0.01)，而且α-淀粉酶和糖化酶在酶解过程中存在明显协同作用(P＜0.05),在玉米组中,处理6组的还原糖生成量数值上极显著高于其他组(9组除外)(P＜0.01),在小麦组中,处理8组极显著高于其他组(9组除外)(P＜0.01),从全价日粮上看,处理6组也极显著高于其它组(9组除外)(P＜0.01)。

2.2 α-淀粉酶和糖化酶对干物质消化率的影响（见表3）

表3 α-淀粉酶和糖化酶对干物质消化率的影响（%）

由表3可知，随着2种酶添加量的提高，3种物质的干物质消化率也相应出现不同程度地增加,而且α-淀粉酶和糖化酶在酶解过程中存在不同程度的协同互作效应（P＜0.05），在玉米组中,处理5组、6组、8组、9组的干物质消化率数值上明显高于其余组（P＜0.05），在小麦组中,处理6组干物质消化率明显高于其他组（8组除外）（P＜0.01），从全价日粮上看,处理6组也明显高于其他组（9组除外）（P＜0.01）。

2.3 α-淀粉酶和糖化酶对离体消化能的影响（见表4）

表4 α-淀粉酶和糖化酶对离体消化能的影响（MJ/kg）

由表4可知：随着α-淀粉酶和糖化酶添加量的提高，3种原料的离体消化能相应出现不程度地增加(P＜0.01),且在酶解过程中存在不同程度的协同互作效应(P＜0.05)，在玉米组中，处理6组、8组的离体消化能高于其余组(P＜0.05)；在小麦组中，处理6组(处理8组除外)离体消化能高于其余组(P＜0.05)，在全价日粮组中，处理6组的离体消化能高于其它组(P＜0.05)。

3 讨论

3.1 添加α-淀粉酶和糖化酶的必要性

近十几年来，有关酶制剂能提高动物的日粮利用率、促进动物消化道健康发育的科学研究报道很多，尤其在单胃动物日粮中的应用非常普遍，但各种酶制剂产品因发酵菌种、底物及发酵条件的不同而使用效果不一。玉米和小麦作为单胃动物主要的能量饲料来源，可占到全价配合日粮配比的30%～70%，所以调控玉米和小麦在体内的利用率，才是当今酶制剂生产商亟待解决的重要问题。

刘涛(2005)[5]指出,饲料原料中只有82%的淀粉可以被消化,未消化的淀粉进入大肠发酵,产生VFA,被吸收进入体内提供能量,但这不能完全释放其能量,这就需要外源酶提高其能量利用率。外源性α-淀粉酶和糖化酶正好弥补内源酶分泌不足,尽可能最大限度地消化淀粉,从而减少后肠发酵,最终减少能量损失。在本试验中,添加α-淀粉酶和糖化酶不同程度的提高玉米、小麦、全价日粮的体外消化率(P＜0.05),释放可溶性还原糖,提高了其离体消化能；在体外酶解过程中,3个测定指标并不是随着α-淀粉酶和糖化酶添加量的提高而直线增加,而是出现了拐点,从结果上看,处理6组和8组的各指标要高于其他处理组(P＜0.05),这也验证了酶与底物之间作用存在高效性,同时说明单胃动物日粮中添加α-淀粉酶和糖化酶是必要可行的。

3.2 α-淀粉酶和糖化酶的协同作用效果研究

在适宜条件下，α-淀粉酶能切开淀粉链内部的α-1,4糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而糖化酶除了能从淀粉链的非还原性末端切开α-1，4糖苷键，也能缓慢切开α-1，6糖苷键，它能很快地把直链淀粉从非还原性末端依次切下葡萄糖单位。

基于以上作用机理，姚卫蓉等(2005)[6]的试验结果表明，α-淀粉酶和糖化酶水解淀粉存在很好的协同作用。张剑等(2007)[7]报道，α-淀粉酶和糖化酶间的互作效应要优于单酶的水解效果。李富伟等(2009)[8]研究也得出，pH值4.6条件下淀粉酶与糖化酶的互作效应明显。本试验模拟胃肠道内环境，采用两步离体消化法，对3种样品进行离体酶解测定的结果表明：α-淀粉酶和糖化酶在酶解3种底物时存在明显的协同互作效应（P＜0.05），这与上述的报道结果是一致的。

4 结论

本试验采用胃蛋白酶-胰酶两步水解法，探讨玉米、小麦及全价日粮中的体外消化情况，结果表明，各组还原糖生成量、干物质消化率、离体消化能均随α-淀粉酶和糖化酶添加量的增加都有不同程度的提高（P＜0.05），且这两种酶制剂之间存在明显协同互作效应（P＜0.05）。综合添加成本等因素考虑，α-淀粉酶和糖化酶在玉米、小麦和全价日粮中的最适添加量分别为500 μg/g和750 μg/g、1 000 μg/g和500 μg/g、500 μg/g和750 μg/g。

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[2] 王前光,贺建华,刘朝干,等.体外酶解法评定酶制剂的应用[J].饲料研究,2006(4):56-58.

[3] 侯小锋.非淀粉多糖酶制剂对肉仔鸡日粮能量代谢率的调控及其体外评定方法的研究[D].山西农业大学,2005.

[4] 黄瑞林,李铁军,谭支良,等.透析管体外消化法测定饲料蛋白质消失率的适宜酶促反应条件研究[J].动物营养学报，1999(4)：51-57.

[5] 刘涛.酶制剂及其底物的研究进展[A].酶制剂在饲料工业中的应用,2005:71-78.

[6] 姚卫蓉,姚惠源.复合淀粉酶酶解淀粉机理探讨[J].工业微生物,2005(4):15-24.

[7] 张剑,张开诚,田辉.混合酶水解水溶性淀粉的研究[J].中国酿造,2007(2):23-26.

[8] 李富伟,汪勇,汤海鸥.淀粉酶和糖化酶体外降解玉米淀粉的机理探讨[J].中国饲料,2009(16):15-16.