混合物料发酵产物小分子肽的测定

朱长波 王劲松 陈清蝉

(1.武汉烁森生物科技有限公司，湖北荆门 448121；2.荆楚理工学院，湖北荆门 448000)

我国每年产生数亿吨的各类糟粕，一方面没能很好的利用造成巨大浪费，另一方面又从国外进口大量大豆。我们将啤酒糟、白酒糟、味精糟、糖糟等农副产品及工业废料作为主要原料，以其他农副产品为辅助原料，加上我们的核心菌种，采用现代生物工程技术和酶工程技术，结合微生态理论，通过多菌种混合固体发酵和添加外源复合酶相结合的先进工艺，生产植物源性酶菌功能营养小肽——肽素35。

过去我们只能用单一的凝胶电泳的检测方法,只能单一的判断小分子肽分子量的范围,不能准确的判断各个分子量段的含量,从而不能准确的判断我们的发酵产品和别人的产品的差异。为了建立一种科学、可靠和稳定的检测方法,我们花了10年时间，通过大量的方法实验证明,Shodex尺寸排阻色谱法是一套比较科学的检测方法,该方法对确定小分子肽含量的测定准确、可靠。

1 待检测原料肽素35的原料组成及比例（见表1）

表1 肽素35的组成(%)

2 小分子肽的分离提取

2.1 蛋白质提取

肽素35样品粉碎，过0．25 mm的筛网，取100 g溶解在水中，定容到1 000 ml，在50℃的振荡水浴锅中振荡提取15 h，得固液混合物。

2.2 蛋白质溶液除杂

提取结束的固液混合物先用纱布粗过滤一次，然后用滤纸细过滤一次，离心（转速4 000 r/min，20 min）再次除去部分固型杂质。取出上清液体放入冰箱待盐析。

2.3 盐析

取800 ml样品蛋白质溶液，称取440 g硫酸铵，逐渐加入到蛋白质溶液中，边加边搅拌。待硫酸铵完全溶解后，放入冰箱中，放置时间15 h。

2.4 离心分离蛋白质

将盐析完成后的蛋白质溶液加入到离心管，将离心机转速调节到6 000 r/min，离心时间20 min。将分离出来的蛋白质用10 ml的水完全溶解，到入10 ml的试剂管中贮存。

2.5 透析

将分离出来的10 ml蛋白质溶液加入到透析袋中（膜孔径2 nm，截留小分子肽），透析时间1 h，充分将蛋白质中的硫酸铵分离出来，避免该试剂带来的试剂误差，透析后得小分肽——肽素35水提物。

3 小分子肽的测定

3.1 检测设备

LC98II-RI凝胶色谱仪、日本Shodex RI-201H示差折光检测器。

3.2 仪器参数

色谱柱：shodes凝胶柱(Column number E008027)；流动相：H2O；流速：1.0 ml/min；标准品：普鲁兰 P-82（内装6瓶不同分子量标准品）；样品：肽素水提物；进样量：10 μl；实测压力：2.4 MPa；检测器：Shodex RI-201h。

3.3 实验内容

3.3.1 标准曲线制作

取各种我们已知分子量的标准品，分别配成0.5%浓度的溶液，用0.45 μm针式滤器过滤。具体标准品浓度见表2。

表2 标准品分子量

取以上标准品，按顺序将以上标准品进样10 μl，得到以下标准曲线。纵坐标是电压值，横坐标是各种样品的响应时间，各点代表相应标准品峰的响应时间。具体见图1。

3.3.2 肽素35水提物图谱

取肽素35水提物,用同样的实验条件进样10 μl,得到测试谱图（见图2）。

图2 肽素35水提物凝胶色谱仪图谱

3.3.3 标准品和肽素35水提物的图谱对比

通过电脑系统将标准曲线图跟肽素35水提物进样曲线合在一起得到合并图形（见图3）。

从图3我们可以找到标准品响应的点，从而找到肽素35水提物的分子量，以及对应的蜂面积所代表含量，故通过面归一法得到肽素35水提物的分子量分布及含量（见表3）。

由表3我们可以看出10 kD以下分量小分子肽所占比例为70.46%。

4 结论

经过我们分离的菌种发酵后的肽素35，经过水提取，盐析分离，透析除盐后，过硅胶层析分离柱后得出一系列峰，通过面积归一法计算出肽素35分子量范围在5～100 kD之间，分子量10 kD以下的占水溶性小分子肽含量的70%以上。该检测方法是可靠的也是可行的。

图3 标准品和肽素35合并图

表3 肽素35水提物的分子量分布