利用核糖体工程选育丙酮丁醇菌提高丁醇产量

陈丽杰，商光来，袁文杰，吴又多，白凤武

大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116024

丁醇作为一种新型的生物燃料，具有其独特的性质：能量密度高、腐蚀性低、挥发性低[1]，与汽油的性质相似，可直接用于现有的发动机系统，已受到世界各国的广泛关注。目前丁醇发酵中，丁醇的产量相对较低，这加大了后续分离成本，降低了其经济实用性，因此提高丁醇产量是提高丁醇产业经济性的手段之一[2]。微生物发酵产业中，微生物菌种起着至关重要的作用。性状优良的高产菌株可以减少发酵和产物分离成本，提高经济效益，具有良好的科学研究价值和市场潜力[3]，因此获得一株高产丁醇菌株成为提高丁醇产量的前提。丁醇本身对发酵菌株C. acetobutylicum 具有很大的毒性。当丁醇浓度达到10~11 g/L时，菌体生长受到强烈抑制，并大量死亡[4]，从而限制更高浓度丁醇的生成，因此菌体对丁醇的耐受性低也是制约丁醇产量提高的重要因素[5]。

核糖体是微生物进行蛋白质合成的重要细胞器，与胞内代谢活动、基本生理过程密切相关。核糖体发生突变将严重影响胞内物质的代谢[6]。核糖体工程技术是近几年发展起来的微生物育种方法。通过向微生物核糖体组分 (核糖体蛋白和 rRNA) 引入点突变，调控代谢系统，诱导或刺激代谢产物的表达，获得代谢产物合成能力提高的突变菌株[7-8]。通常使用链霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素等抗生素诱变微生物，使其核糖体发生突变。核糖体工程技术具有较好的诱变效果，目前主要用于提高微生物代谢物的产量及化学耐受程度等[6,9-10]。Kurosawa等[11]以枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis 168为出发菌诱变获得链霉素突变株，其α-amylase和protease产量提高了 20%~30%。Hosokawa等[12]对恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KH146-2进行链霉素、利福平和庆大霉素的抗性诱变，筛选得到的抗生素突变株对 4-羟基苯甲酸丁酯耐受程度由出发菌的0.8%提高到5%。

与其他的育种方法相比，核糖体工程简单易行，无需特殊设备，便于大批量的筛选。在所使用的抗生素中，链霉素诱变效果较好，正突变和增产率高，且其抗性突变在诱变育种中应用较多[10]。核糖体工程用于C. acetobutylicum的诱变筛选，以提高丁醇产量目前还没有报道。鉴于此，本文通过核糖体工程技术，使用链霉素诱变C. acetobutylicum L7，期望获得高产高耐丁醇菌株，解决丁醇产量低的实际问题，并为后续的研究工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

本实验室驯化保存的丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum L7。

1.1.2 培养基

活化培养基 (g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨30，酵母粉10。

发酵培养基 (g/L)：葡萄糖70，CH3COONH42.3，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO4·3H2O 0.5，KH2PO40.5，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，酵母粉2，生物素0.01，对氨基苯甲酸0.01，pH 5.5。

平板培养基 (g/L)：葡萄糖30，CH3COONH42.3，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO4·3H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，胰蛋白胨6，琼脂20，pH 6.2。

抗生素：配制浓度为20 g/L的链霉素母液，保存于−20 ℃。使用时按一定比例稀释。

所用培养基均在121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

菌种活化：将1 mL冷冻保藏的菌种接种于20 mL活化培养基中，37.5 ℃厌氧箱 (Forma 1029，Thermo Fisher Scientific) 中活化培养。

摇瓶培养：将活化好的菌种以10% (V/V)的接种量接种于110 mL发酵培养基中，37.5 ℃厌氧箱中静置培养。

发酵培养：1.2 L发酵培养基装入3 L发酵罐(1.5BG-4-3000，上海保兴生物公司) 中，通氮气30 min，保证罐内厌氧环境。将菌种以10% (V/V)的接种量接于发酵罐内，发酵温度37.5 ℃，转速150 r/min。

1.2.2 菌体浓度的测定

在620 nm测量菌体的吸光度作为菌体的浓度 (OD620)，空白对照为离心后的发酵液。

1.2.3 链霉素最小抑菌浓度的确定

将处于对数生长期的菌液 (OD620≈1.0) 涂布于含有不同浓度 (0、2、4··10··50) mg/L的链霉素平板上，每个平板100 µL，相同链霉素浓度设置3个平行，37.5 ℃厌氧箱中培养2 d，观察菌落的生长情况，记录无菌落生长的最小链霉素浓度，即为链霉素对C. acetobutylicum L7的最小抑菌浓度[13]。

1.2.4 核糖体工程诱变筛选 C. acetobutylicum L7技术路线

使用链霉素对C. acetobutylicum L7进行核糖体工程诱变育种。将活化好的菌液涂布于含有4~5倍MIC的链霉素平板上，培养4~5 d。挑取直径较大或形态与原始菌有差异的菌落，96深孔板活化培养20 h，以10% (V/V)的接种量接于发酵培养基中培养72 h，气相色谱检测丁醇产量，比较得出产量提高较多的菌株 (以原始菌为对照)。再以其为出发菌，涂布获得单菌落，将其挑至链霉素平板上，此时浓度比前次筛选菌株时增加5 mg/L，挑取菌落进行发酵检测，重复以上步骤直到获得高产菌株。经过长时间大批量的诱变筛选，最终获得丁醇产量提高率在10%左右的菌株。以上操作均在37.5 ℃厌氧箱中进行。诱变筛选技术路线如图1所示。

1.2.5 氧化还原电位 (ORP) 和pH值的测定

分别采用氧化还原电极 (Pt4805-DPAS-SCK8S, Mettler Toledo) 和 pH电极 (405-60-T-S7/ 120/9848，Mettler Toledo) 测定。

1.2.6 糖浓度的测定

葡萄糖浓度使用SBA-40E生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所) 测定。发酵液离心，取上清稀释至糖浓度小于1 g/L，取25 μL稀释液直接进样，读取数值，并计算发酵液的糖浓度。

图1 核糖体工程筛选丁醇高产菌路线图Fig. 1 Schematic diagram of screening for high butanol-yield strain by ribosome engineering.

1.2.7 溶剂及有机酸的测定

Agilent6890气相色谱测定发酵液中各溶剂的含量。检测条件：毛细管色谱柱 (30 m×0.25 mm× 0.50 µm)，柱温120 ℃；进样口温度250 ℃；FID检测器温度300 ℃。H2流速40 mL/min；空气流速 400 mL/min；N2流速 30 mL/min，进样量0.2 µL。采用内标法测量，内标物为异丁醇。

Waters1525液相色谱测定有机酸浓度。检测条件：Aminex HPX-87H 有机酸分析柱(300 mm×7.8 mm)，柱温 50 ℃，二极管阵列检测波长210 nm，示差折光检测器温度50 ℃。流动相及流速：0.005 mol/L H2SO4，0.5 mL/min，进样量：20 µL。

1.2.8 发酵液粘度测定方法

采用NDJ-1旋转式粘度计 (上海方瑞仪器有限公司) 测定。选择合适转子，将其浸没在待测发酵液中，室温下调整到合适的转速对发酵液粘度进行测定。

1.2.9 丁醇耐性实验

将活化好的菌种以 5% (V/V)的接种量接种于500 mL活化培养基中，37.5 ℃厌氧箱中培养。待菌体生长到OD620≈1.0时，充分混匀，分装于4个摇瓶中，每瓶100 mL，添加丁醇至浓度为0、 6、12、14 g/L。测定不同丁醇浓度下菌体的生长情况，以OD620表示。

2 结果与分析

2.1 链霉素对C. acetobutylicum L7的最小抑菌浓度

微生物具有一定的抗生素耐受浓度，高抗生素浓度下微生物全部被杀死，而低浓度下则发生突变的概率极低，不易获得突变菌株[14]，因此确定抗生素筛选浓度非常重要。合适的抗生素浓度将有利于诱变工作的进行，提高诱变效率。最小抑菌浓度 MIC是反应抗菌活性和能力的一个指标，定义抗生素的 MIC为无菌落生长的最小抗生素浓度。

按照 1.2.3方法进行平板涂布，并记录不同链霉素浓度下C. acetobutylicum L7菌落生长情况，如图2所示。从图中可以看出，无链霉素的平板中，C. acetobutylicum L7生长好，培养至2 d时菌体铺满整个平板，无单菌落 (图A)；在含有链霉素的平板上，菌体生长受到抑制。10 mg/L链霉素浓度下，C. acetobutylicum L7在2 d内无菌落生长 (图B)，确定10 mg/L为MIC；在40~50 mg/L的链霉素平板中，大部分菌体被杀死，培养至4 d只有2~4个菌落存活，形态如图C和图D。生长出的菌落为链霉素抗性菌，有可能发生突变。

在确定链霉素的MIC后，按照1.2.4设计的技术路线，通过平板转接逐次提高链霉素浓度开始诱变筛选C. acetobutylicum L7，以获得丁醇高产菌株。

2.2 丁醇高产菌S3的获得及传代稳定性

得到丁醇高产的 C. acetobutylicum一直是人们关注的焦点。通过使用链霉素的核糖体工程育种技术大批量筛选，共获得 6株丁醇产量较高的菌株，其中7倍MIC链霉素抗性菌株S3丁醇产量最高，达到(12.00±0.10) g/L，如表 1所示。

通过分析表中筛选结果，得出链霉素用于诱变C. acetobutylicum提高丁醇产量，效果比较理想。抗性菌中，S13丁醇产量最低，为(11.72±0.11) g/L，提高了10.05%；其他5株菌丁醇产量提高率在10.14%~12.68%。

连续传代次数用于表达微生物菌株的使用寿命。传代稳定说明菌株性状优良，不易衰退[15]。通过核糖体工程技术筛选所获得的6株菌，对其进行传代发酵实验，发现S3的发酵性能最稳定，结果见表2。从表中可以看出，传代5次，S3的丁醇和总溶剂产量较稳定，分别维持在11.8 g/L和18.7 g/L左右，相比于原始菌一直稳定高产；丁醇在总溶剂中所占比例为0.62~0.63。说明S3遗传稳定性较好，有利于后续研究的进行。

2.3 S3与C. acetobutylicum L7的生长及发酵特性

为考察S3生长及发酵情况，将S3进行上罐发酵实验，并与原始菌进行了对比。两者的生长、耗糖、各溶剂、有机酸的生成及 ORP变化情况如图3~5所示。

图2 链霉素平板中C. acetobutylicum L7的生长情况Fig. 2 The growth of C. acetobutylicum L7 on streptomycin plates with different concentrations. (A) 0 mg/L streptomycin. (B) 10 mg/L streptomycin. (C) 40 mg/L streptomycin. (D) 50 mg/L streptomycin.

表1 核糖体工程用于C. acetobutylicum L7的筛选结果Table 1 The high butanol-producing Clostridium strains by ribosome engineering

表2 S3传代稳定性Table 2 The genetic stability of S3

图3 原始菌 (A) 和S3 (B) 的OD620、pH及残糖曲线Fig. 3 Time course of OD620, pH and residual sugars by C. acetobutylicum L7 (A) and S3 strain (B).

图4 原始菌 (A) 和S3 (B) 的发酵生产溶剂及有机酸曲线Fig. 4 Time course of solvents and acids production by C. acetobutylicum L7 (A) and S3 strain (B).

图5 原始菌和S3的ORP曲线Fig. 5 Time course of ORP by C. acetobutylicum L7 and S3 strain. ORP: oxidoreduction potential.

丁醇发酵分为两个时期：产酸期，菌体快速生长，产生有机酸 (乙酸和丁酸)，pH降低；产溶剂期，菌体代谢相对缓慢，溶剂 (丙酮、丁醇和乙醇) 大量生成，并伴随乙酸和丁酸的重吸收，pH缓慢升高。发酵过程中，菌体为维持自身代谢，消耗大量的葡萄糖。如图3和图4所示，S3和原始菌在产酸期代谢旺盛，生物量 OD620快速增加；14 h左右，二者pH降到最低，即pH拐点，此时S3的pH值 (4.3) 和原始菌的 (4.2)相当，发酵液中积累乙酸的量分别为2.01 g/L、2.05 g/L；丁酸2.06 g/L、2.13 g/L，为发酵过程中酸积累的最大浓度。之后有机酸毒性显现，C. acetobutylicum开始酸的重吸收，酸浓度降低，溶剂快速生成，pH升高。随着发酵进行，S3和原始菌OD620达到最大，分别为3.18、3.19，此时51.4%的葡萄糖已被消耗。之后10 h, 溶剂继续生成，丁醇毒性开始发挥作用，菌体OD620下降；此阶段 S3和原始菌分别产生 3.78 g/L、2.26 g/L的丁醇，S3优势比较明显。随着丁醇浓度的增加，毒性进一步加大，加上营养匮乏，菌体代谢停止，发酵结束，各溶剂产量达到最大。

微生物代谢过程中会产生和消耗氧化还原力：NAD(P) 与 NAD(P)H，且胞内 NAD(P)/ NAD(P)H水平与菌体代谢和溶剂产生紧密相关[16-18]。氧化还原电位 (ORP) 是发酵体系氧化-还原性的外在反映[19]。分析原始菌和S3的发酵过程，发现 ORP变化与菌体生长、有机酸产生和重吸收、溶剂生成、pH变化密切偶联。如图3~5所示，菌体生长代谢产生大量有机酸，pH快速下降；同时产生大量能量和NAD(P)H，ORP随之降低。当有机酸积累到一定程度，毒性显现，其分子态形式可以透过细胞膜，自由进入菌体产生解偶联毒害作用[20-21]。于是开启酸的重吸收通路，溶剂大量生成，有机酸浓度下降，pH缓慢升高，ORP趋向稳定。随丁醇浓度的增加，细胞代谢受到抑制，菌体加速死亡，ORP升高至发酵结束。ORP在发酵全程伴随菌体生理代谢发生响应变化[16]。发酵前24 h，S3的ORP表观响应更为迅速，在−493 mV至−470 mV之间变化，浮动较大；随后的15 h内，其维持在−490 mV左右，相比原始菌，此阶段还原力依然较强，产生5.52 g/L丁醇，而原始菌只生成 3.15 g/L，说明在产溶剂期为主的生理代谢阶段，S3迅速积累溶剂丁醇，并具有更高的代谢通量，与 ORP的阶段性稳定 (−490 mV状态下) 存在一定的关联性。针对C. acetobutylicum进行ORP调控以提高菌体发酵性能的研究已有报道[22]，全程控制ORP有利于菌体提前进入溶剂期，溶剂产量提高，发酵时间缩短，且 ORP的有效调控将改变细胞的代谢流及生理过程。本研究通过核糖体工程选育的菌株S3，其发酵过程ORP变化与丁醇代谢通量亦存在明显关联，暗示若ORP控制在−490 mV，菌体丁醇代谢通量极有可能进一步提高。

对S3与C. acetobutylicum L7发酵终点时，消耗糖浓、各溶剂产量及丁醇/糖等参数进行了比较 (表3)。

表3 S3与原始菌的比较Table 3 The comparison of S3 with C. acetobutylicum L7

C. acetobutylicum发酵产生3种溶剂：丙酮(A)、丁醇 (B) 和乙醇 (E)。发酵终点，A、B、E三者比例一般在3∶6∶1左右。表3数据显示，S3和原始菌的 A/B/E比例相差不大；生长过程中消耗的葡萄糖和最大生物量OD620基本相同，而最终S3生成的丁醇和乙醇比原始菌高，分别提高11.2% (1.26 g/L)、50% (0.57 g/L)，丙酮相差很小，总溶剂相应提高9.7% (1.79 g/L)；丁醇/糖转化率由原始菌的0.19提高到0.22。S3发酵结束用时52 h，相比原始菌少9 h，发酵周期缩短，而产生的丁醇较多，说明S3丁醇的生产效率较高，达到 0.24 g/(L·h)，相比提高 30.5%；因此S3在发酵中将更有优势，可以产生较多的溶剂，其经济可行性得到提高。整个丁醇发酵过程中，有机酸的重吸收与溶剂产生相偶联。S3与原始菌有机酸的重吸收量分别为2.70 g/L、2.89 g/L，相差不大；二者丙酮产量基本相同，而S3的丁醇与乙醇总产量相比原始菌高1.83 g/L，可以推测S3的丁醇与乙醇代谢通量有可能发生了变化。生成丁醇与乙醇的途径中，丁醇脱氢酶和乙醇脱氢酶是两个关键酶，且相互关联；二者结构是否发生改变或活性增强，是否为核糖体工程作用的靶点，有待于下一步进行研究确定。

丁醇发酵后期，发酵液里存有大量菌体和一些其他物质，例如金属离子、无机盐、菌体自溶产生的蛋白、多糖、核酸等，致使发酵液具有一定的粘性，影响了整个发酵体系的传质传热，并增加搅拌的能量消耗[23]。若粘度较大，发酵效果和设备利用率将降低，不利于后续工作的进行，增加溶剂分离的难度。对S3发酵液的粘度进行考察，发现其粘度由原始菌的 10 mPa·s减小到4 mPa·s，降低了 60%；这将便于溶剂分离和发酵工作的展开，从而减少发酵成本。

2.4 S3与C. acetobutylicum L7的丁醇耐性

微生物发酵法生产生物燃料时例如乙醇、1-丙醇等，目标产物通常会对菌体产生很大的毒害作用，影响菌体生长。丁醇发酵中，丁醇因其疏水性 (离液序列高) 堆积在细胞膜表面，干扰膜功能，其通透性和流动性增加，使ATP、离子、磷脂、RNA、蛋白等流失，破坏适合菌体生长的pH，影响胞内新陈代谢和能量的运输及转换，加速了菌体的死亡[5,24-25]。丁醇的毒性作用限制了发酵液中丁醇的浓度，增加后期的分离成本。因此对S3的丁醇耐性进行了考察，如图6所示不同丁醇浓度下 (0、6、12、14 g/L)，C. acetobutylicum L7与S3菌体的生长情况。

图6 不同丁醇浓度下原始菌与S3的生长情况Fig. 6 Growth profles of C. acetobutylicum L7 and S3 challenged with different concentration of butanol. (A) 0 g/L butanol. (B) 6 g/L butanol. (C) 12 g/L butanol. (D) 14 g/L butanol.

从图中可以看出，在添加丁醇的情况下，S3的生长均强于原始菌，同时间点OD620一直较原始菌大，表现出较强的丁醇耐受力。原始菌在12 g/L丁醇中，起初能够维持生长，最大OD620为1.39；之后因其丁醇耐受低，菌体大量死亡。在添加14 g/L丁醇浓度下，S3菌体OD620缓慢增加，最大为 1.41；而原始菌无法存活，OD620一直减小，得出S3的丁醇耐受浓度比原始菌高，分别为14 g/L和12 g/L。

丁醇对C. acetobutylicum的毒害作用相当严重。无丁醇的培养基中，原始菌和S3生长良好，最大OD620各为2.43、2.46；含有丁醇的情况下，原始菌与S3的生长受到明显抑制，菌体增殖缓慢，最大OD620都未能达到2.4；并且4种丁醇浓度下，出现正增殖的时间逐渐缩短，分别为：原始菌12 h，12 h，6 h，0；S3 15 h，15 h，9 h，6 h。在耐受丁醇极限浓度下 (原始菌 12 g/L，S3 14 g/L)，OD620只能增殖到1.40，比无丁醇浓度下减小42.9%。可以得出，丁醇毒性严重影响了菌体的生长代谢。文献指出[26-27]，丁醇作用下，菌体细胞膜的组成发生很大改变；菌体不能维持内部pH，ATPase活性降低。基于此，下一步可对S3进行丁醇耐性机理的探索，并提出提高丁醇耐受程度的策略，为进一步提高丁醇产量奠定基础。

3 结论

本研究首次使用链霉素诱变 C. acetobutylicum L7提高丁醇产量。筛选获得的菌株，丁醇产量提高率均超过10%；其中S3产量最高，达到12.48 g/L，丁醇耐受程度也有显著提高，表明核糖体工程技术在筛选丁醇高产菌株方面有效、可行。通过分析比较 S3与C. acetobutylicum L7发酵性能差异，推测S3的丁醇及乙醇代谢通量有可能发生变化，后续研究工作将对菌株S3的抗性突变、丁醇耐受机理及代谢通路作进一步的研究，为更大程度提高丁醇产能提供技术支持。

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