谷氨酸棒杆菌NAD激酶的过表达对L-异亮氨酸合成的促进作用

还晓静，李坤，史锋，王小元

1 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122

2 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122

工业生物技术

谷氨酸棒杆菌NAD激酶的过表达对L-异亮氨酸合成的促进作用

还晓静1,2，李坤1,2，史锋1,2，王小元1,2

1 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122

2 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122

NAD激酶催化辅酶Ⅰ[NAD(H)]发生磷酸化，转变成辅酶 Ⅱ[NADP(H)]，而还原态辅酶Ⅱ (NADPH) 是L-异亮氨酸合成的必要辅因子。为了提高NADPH的供应，首先克隆了谷氨酸棒杆菌NAD激酶基因ppnK，并利用大肠杆菌-棒状杆菌诱导型穿梭表达载体pDXW-8和组成型穿梭表达载体pDXW-9在L-异亮氨酸合成菌——乳糖发酵短杆菌JHI3-156中进行表达。摇瓶发酵后，ppnK诱导表达菌JHI3-156/pDXW-8-ppnK的NAD激酶酶活 (4.33±0.74 U/g) 比pDXW-8空载菌提高了83.5%，辅酶Ⅱ与辅酶Ⅰ的比例提高了63.8%，L-异亮氨酸产量 (3.86±0.12 g/L) 提高了82.9%；ppnK组成表达菌JHI3-156/pDXW-9-ppnK的NAD激酶酶活 (7.67±0. 65 U/g)比pDXW-9空载菌提高了2.20倍，辅酶Ⅱ与辅酶Ⅰ的比例提高了1.34倍，NADPH含量提高了21.7%，L-异亮氨酸产量 (2.99±0.18 g/L) 提高了41.7%。这说明NAD激酶有助于辅酶Ⅱ的供应和L-异亮氨酸的生物合成，这对于其他氨基酸的生产也有一定的参考依据。

L-异亮氨酸，NAD激酶，诱导型表达，组成型表达，乳糖发酵短杆菌

Abstract:NAD kinase catalyzes the phosphorylation of coenzyme Ⅰ [NAD(H)] to form coenzyme Ⅱ [NADP(H)], and NADPH is an important cofactor in L-isoleucine biosynthesis. In order to improve NADPH supply,ppnK, the gene encoding NAD kinase inCorynebacterium glutamicumwas cloned and separately expressed in an L-isoleucine synthetic strain,Brevibacterium lactofermentumJHI3-156, by an inducible expression vector pDXW-8 and a constitutive expression vector pDXW-9. Compared with the control strain JHI3-156/pDXW-8, NAD kinase activity of the inducibleppnK-expressing strain JHI3-156/pDXW-8-ppnKwas increased by 83.5%. NADP(H)/NAD(H) ratio was also increased by 63.8%. L-isoleucine biosynthesis was improved by 82.9%. Compared with the control strain JHI3-156/pDXW-9, NAD kinase activity of the constitutiveppnK-expressing strain JHI3-156/pDXW-9-ppnKwas increased by 220%. NADP(H)/NAD(H) ratio and NADPH concentration were increased by 134% and 21.7%, respectively. L-isoleucine biosynthesis was increased by 41.7%. These results demonstrate that NAD kinase can improve the coenzyme Ⅱ supply and L-isoleucine biosynthesis, which would also be useful for biosynthesis of other amino acids.

Keywords:L-isoleucine, NAD kinase, inducible expression, constitutive expression,Brevibacterium lactofermentum

L-异亮氨酸 (L-isoleucine，Ile) 是高等动物的8种必需氨基酸之一，世界卫生组织建议体重为70 kg的成年人每日摄取1.4 g。L-异亮氨酸在饲料[1]、食品、医药[2]行业的应用非常广泛，用量逐年增长[3]。在国内，工业上大多采用诱变筛选获得的菌株通过发酵生产L-异亮氨酸，产品得率及质量都难以参与国际竞争，生产水平远远不能满足需求。

应用基因工程手段进行生产菌的定向育种，能打破种属界限，集中不同菌株的优点，从而选育出高产、优质的基因工程菌[4-5]。L-异亮氨酸的合成从天冬氨酸开始，涉及 10步反应。除了可以通过改造合成途径的关键酶[6-7]之外，还可以通过调节辅酶的供应来对 L-异亮氨酸的合成途径进行分子改造。L-异亮氨酸合成所需的关键辅酶是 NADPH，它是天冬氨酸 β-半醛脱氢酶(ASD)、高丝氨酸脱氢酶 (HD) 和乙酰羟酸合酶(AHAIR) 的辅酶。NADPH还是细胞内最重要的还原力，在还原性生物合成中起到氢供体的作用，高效供应NADPH有利于发挥菌株的合成潜力[8-9]，推动L-异亮氨酸的进一步积累。

图1 辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的生物合成途径Fig.1 Biosynthetic pathway of coenzyme Ⅰ and Ⅱ.

细胞内NADPH的主要供应渠道是HMP途径和NAD激酶，其中HMP途径利用氧化态辅酶Ⅱ(NADP+) 作为电子受体生成还原态辅酶Ⅱ(NADPH)，NAD激酶则催化辅酶Ⅰ发生磷酸化生成辅酶Ⅱ(图1)。HMP途径在产生NADPH的同时，会消耗其他底物，如葡萄糖[10-11]；而NAD激酶则只调节辅酶的转变，不消耗其他碳源底物。NAD激酶包括NAD+激酶和NADH激酶，NAD+激酶利用 ATP或多聚磷酸盐[poly(P)]作为磷酸供体，催化NAD+发生磷酸化，生成NADP+；而NADH激酶则催化NAD+和NADH发生磷酸化，生成NADP+和NADPH[12]。NAD激酶催化的反应构成了NADP+生物合成途径的最后一步，是生物细胞内唯一一种催化 NAD(H) 生成NADP(H) 的反应。近年来，对NAD激酶的分子基础研究表明绝大多数生物体内都存在NAD激酶[13]，它具有重要的生理功能。在氨基酸的主要生产菌谷氨酸棒杆菌中，存在一种利用 ATP和poly(P) 作为磷酸供体，催化NAD+和NADH发生磷酸化的NAD激酶，即poly(P)/ATP-NAD激酶 (PpnK)。最近Lindner等在L-赖氨酸生成菌中表达PpnK，研究显示其有利于L-赖氨酸积累[14]。

目前国内应用基因工程手段来选育 L-异亮氨酸生成菌的研究已初步开展，但还未研究利用辅酶调控技术来提高其产量。L-异亮氨酸的生产菌株多以亲缘关系相近的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum[15]和乳糖发酵短杆菌Brevibacterium lactofermentum[16]为主。本文通过克隆谷氨酸棒杆菌的ppnK基因，并在一株L-异亮氨酸合成菌——乳糖发酵短杆菌 JHI3-156中表达，研究了它对胞内辅酶供应和对L-异亮氨酸积累的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

本实验中所用到的菌株和质粒见表1。

1.1.2 主要培养基

LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，相应的固体培养基中添加20 g/L的琼脂粉，需要时，添加50 mg/L卡那霉素。

LBG培养基：在 LB 培养基中添加50 g/L葡萄糖，需要时，添加30 mg/L卡那霉素。

活化培养基：在LB培养基中添加50 g/L葡萄糖和50 g/L牛肉浸膏，相应的固体培养基中添加15 g/L的琼脂粉，需要时，添加30 mg/L卡那霉素。

种子培养基：葡萄糖25 g/L，尿素1.25 g/L，玉米浆20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 7.0，需要时，添加30 mg/L卡那霉素。

发酵培养基：葡萄糖100 g/L，(NH4)2SO420 g/L，玉米浆20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L和CaCO320 g/L，pH 6.7，需要时，添加30 mg/L卡那霉素。携带诱导型表达载体的重组菌株，在发酵接种后10 h添加IPTG (终浓度为1 μmol/L) 诱导。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计和ppnK基因的扩增

根据 NCBI中报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的ppnK基因 (GenBank Accession No. Cg1601) 设计上游引物ppnK(F) 和下游引物ppnK(R)，引物序列见表2。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

表1 本实验所用菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究使用的PCR引物Table 2 PCR primers used in this study

将谷氨酸棒杆菌ATCC13032用LBG培养基在37 ℃、200 r/min培养过夜，收集3 mL细胞，提取其基因组。以该基因组 DNA为模板、ppnK(F) 和ppnK(R) 为引物，通过PCR扩增出NheⅠ-ppnK-Hind Ⅲ片段。

1.2.2 重组质粒和工程菌株的构建

纯化后的PCR产物NheⅠ-ppnK-Hind Ⅲ用NheⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，分别定向连接至大肠杆菌/棒状杆菌诱导型表达载体 pDXW-8[17]和组成型表达载体pDXW-9[18]，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到阳性转化子 DH5α/pDXW-8-ppnK和 DH5α/pDXW-9-ppnK。将阳性转化子提交上海生工生物工程有限公司测序。

参照文献方法[17]制备乳糖发酵短杆菌JHI3-156感受态细胞。将验证正确的质粒pDXW-8、pDXW-9、pDXW-8-ppnK和pDXW-9-ppnK用电转化方法转入JHI3-156感受态细胞，于LBHIS培养基[17]中培养72 h，挑取转化子，得到ppnK表达菌株和空载菌株。

1.2.3 重组菌株的发酵

取出发菌株 JHI3-156和重组菌株在活化平板上划线，于30 ℃培养24 h。挑一满环活化平板上的菌体接种至50 mL种子培养基 (250 mL锥形瓶) 中，在30 ℃、200 r/min培养18 h。种子液按终浓度OD562=1.0的接种量转接入50 mL发酵培养基(500 mL锥形瓶)，在30 ℃、200 r/min发酵72 h。进行了两批发酵，每批每株菌株设3个平行样，所有结果为这2批发酵的平均值。

发酵开始后，每隔6 h取样，测定发酵液菌体浓度和葡萄糖含量。测定葡萄糖含量时，取1 mL培养液，12 000 r/min离心5 min得到发酵上清液，稀释100倍后，用山东省科学院生产的生物传感分析仪测定葡萄糖含量。

1.2.4 NAD激酶酶活的测定

发酵结束后，收集菌体，用 KNDE缓冲液(1.0 mmol/L K2HPO4-KH2PO4，pH 7.0，0.1 mmol/L NAD+，0.5 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA) 洗涤3次，加入10 mL KNDE缓冲液重悬细胞，加入100 μL溶菌酶 (100 g/L) 处理后，在冰水里超声波破碎2 h，在4 ℃、12 000 r/min离心10 min后，收集上清。上清中蛋白质含量用Bradford法在核酸-蛋白定量仪 (GeneQuant公司) 上测定。ATP-NAD+激酶的酶活测定方法参照文献[19]，测定吸光度值OD340变化。酶活定义为：在30 ℃、1 mL反应体系中，每分钟催化得到1 µmol NADP+的酶量为1 U，比酶活用U/mg或U/g表示。

1.2.5 NAD(H)和NADP(H)浓度的测定

发酵24 h时，取1 mL发酵液2份，离心去上清，菌体置于液氮急速淬灭后存放于-70 ℃冰箱。测定辅酶含量时，取出菌体，置于冰水混合物中用冷的PBS (pH 7.5) 清洗1次，然后参照文献方法[20]测定 4种辅酶 NAD+、NADH、NADP+、NADPH含量。细胞干重按经验公式计算：Y (g/L DCW) =0.6495×OD562−2.7925；细胞体积按每mg DCW为1.6 μL计算。

1.2.6 氨基酸含量的测定

发酵过程中，每隔6 h取1 mL培养液，12 000 r/min离心5 min得到发酵上清液，用5%三氯乙酸稀释50倍，静置1 h，12 000 r/min离心10 min得到上清液，用0.22 μm滤膜过滤后，采用高效液相色谱系统 (Agilent公司1200series色谱仪) 自动柱前衍生化法测定氨基酸含量。色谱柱：Agilent Eclipse-AAA柱。流动相水相(1 L)：4.52 g无水乙酸钠、200 μL三乙胺、5 mL四氢呋喃、pH 7.2；有机相 (1 L)：4.52 g无水乙酸钠、400 mL甲醇、400 mL乙腈。色谱条件：柱温40 ℃，流速1.0 mL/min，DAD检测器。

2 结果与分析

2.1ppnK表达质粒和菌株的构建

以谷氨酸棒杆菌 ATCC13032基因组为模板，通过 PCR扩增得到 1 002 bp的NheⅠ-ppnK-Hind Ⅲ基因片段，分别连入 9 548 bp的pDXW-8和8 351 bp的pDXW-9表达载体中构建ppnK表达质粒。

pDXW-8为大肠杆菌-棒状杆菌诱导型穿梭表达载体，该载体使用lacIPF104控制的tac启动子和rrnBT1T2终止子来控制插入基因的表达[17]。pDXW-9是大肠杆菌-棒状杆菌组成型穿梭表达载体，该载体使用tac启动子和rrnBT1T2终止子来控制目的基因的表达[18]。

将基因片段NheⅠ-ppnK-Hind Ⅲ和表达载体pDXW-8或pDXW-9用限制性内切酶NheⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切，酶切产物纯化后用 T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，得到 DH5α/pDXW-8-ppnK和 DH5α/pDXW-9-ppnK转化子。提取质粒，经过HindⅢ单酶切和ppnK基因扩增、测序，证明构建得到10 488 bp的pDXW-8-ppnK和9 291bp的pDXW-9-ppnK重组质粒。

将重组质粒pDXW-8-ppnK和pDXW-9-ppnK电转化乳糖发酵短杆菌JHI3-156，得到JHI3-156/pDXW-8-ppnK和 JHI3-156/pDXW-9-ppnK转化子，提取质粒，通过Hind Ⅲ单酶切和ppnK基因扩增，证明构建得到 JHI3-156/pDXW-8-ppnK和JHI3-156/pDXW-9-ppnK重组菌株。将空载体pDXW-8和 pDXW-9转化 JHI3-156，得到JHI3-156/pDXW-8和 JHI3-156/pDXW-9空载菌株。

2.2 重组菌的摇瓶发酵

将构建的 4株重组菌 JHI3-156/pDXW-8、JHI3-156/pDXW-9、JHI3-156/pDXW-8-ppnK、JHI3-156/pDXW-9-ppnK与出发菌JHI3-156进行摇瓶发酵，测定发酵过程中菌体的生长状况、NAD激酶表达情况和 ATP-NAD+激酶酶活、辅酶含量以及L-异亮氨酸产量。通过比较各菌株的发酵性能差异，分析诱导型和组成型表达 NAD激酶对L-异亮氨酸产量的影响。

2.2.1 重组菌的生长情况

摇瓶发酵72 h，各菌株的生长情况见图2。发酵过程中ppnK表达菌和出发菌生长状态良好，36 h后进入稳定期，之后菌体缓慢增长。出发菌 JHI3-156在无抗生素和诱导剂的条件下培养，生长最好，72 h时OD562值达到26.8±1.8，而pDXW-8和 pDXW-9空载菌则因携带了质粒生长减缓。ppnK的诱导表达对细胞生长无不良影响，72 h时OD562为 24.9±0.8，比空载菌株JHI3-156/pDXW-8 (18.9±0.3) 提高了 31.7%。ppnK组成型表达对菌体的生长也有促进作用，72 h时OD562为25.0±0.5，比空载菌株JHI3-156/pDXW-8 (20.4±0.2) 提高了 22.5%，说明 NAD激酶的表达有助于细胞生长。

2.2.2 重组菌的胞内NAD激酶酶活

谷氨酸棒杆菌的 PpnK是一种利用 ATP和poly(P) 作为磷酸供体，催化NAD+和NADH (辅酶Ⅰ) 发生磷酸化生成NADP+和NADPH (辅酶Ⅱ) 的NAD激酶。各菌株发酵72 h后细胞破碎液上清中ATP-NAD+激酶的活性如图3所示。而它们的ATP-NADH激酶活性很低。

图2 乳糖发酵短杆菌摇瓶发酵生长曲线Fig.2 Cell growth of fiveBrevibacterium lactofermentumstrains.

在出发菌和两株空载菌中ATP-NAD+激酶的酶活力较低，而在ppnK表达菌中，酶活显著提高，其中ppnK组成型表达菌的ATP-NAD+激酶酶活 (7.67±0.65 U/g) 比 pDXW-9空 载 菌(2.40±0.23 U/g) 提高了2.20倍，ppnK诱导型表达菌的酶活 (4.33±0.74 U/g) 比pDXW-8空载菌(2.36±0.72 U/g) 提高了83.5%，说明ppnK基因的表达提高了细胞内NAD激酶活力。

2.2.3 重组菌的胞内辅酶含量

由于6～36 h是菌体的快速生长期 (图2)，而JHI3-156/pDXW-8-ppnK在发酵10 h进行诱导表达，于是我们检测了发酵24 h时各菌株胞内的4种辅酶含量，结果见表3。

图3 发酵菌株细胞内的ATP-NAD+激酶活性Fig.3 ATP-NAD+kinase activities of fiveBrevibacterium lactofermentumstrains.

表3 乳糖发酵短杆菌发酵24 h时的细胞内辅酶含量Table 3 Intracellular NAD+, NADH, NADP+, and NADPH concentrations of fiveBrevibacterium lactofermentumstrains after fermentation for 24 h

由表3可知：发酵24 h，ppnK诱导表达菌的细胞内 NADP+浓度比 pDXW-8空载菌高80.9%，辅酶Ⅱ(NADP++NADPH) 与辅酶Ⅰ(NAD++NADH) 的比例比空载菌高63.8%，比出发菌JHI3-156高1.80倍；ppnK组成型表达菌的细胞内NADP+浓度比pDXW-9空载菌高88.0%，NADPH浓度比空载菌高21.7%，而辅酶Ⅱ与辅酶Ⅰ的比例比空载菌高1.34倍，比JHI3-156高2.56倍。说明在发酵24 h时，重组菌中ppnK基因的过量表达和NAD激酶酶活的提高促进了胞内辅酶Ⅱ的合成，其中ppnK基因的组成型表达更有利于提高细胞内NADP+与NADPH的供应。

2.2.4 重组菌发酵后的氨基酸含量

最后我们检测了发酵过程中重组菌和出发菌的发酵液中葡萄糖和 L-异亮氨酸含量变化(图 4)。

图4 乳糖发酵短杆菌摇瓶发酵过程曲线Fig.4 Process curves of fiveBrevibacterium lactofermentumstrains. (A) Concentration of glucose. (B) Concentration of L-isoleucine.

从图4中可以看出，5株菌株消耗葡萄糖的规律是基本一致的，在发酵过程的12～48 h快速消耗葡萄糖；5株菌株的L-异亮氨酸积累进程则存在较大差异，在发酵12 h前各个菌株仅合成少量的L-异亮氨酸，在18 h后，添加诱导剂的诱导表达菌的 L-异亮氨酸合成速率开始高于其他菌株，在24 h后产量开始明显增加，而在36 h后组成型表达菌也开始以较快的速度积累 L-异亮氨酸。在发酵72 h后，ppnK诱导表达菌的L-异亮氨酸产量 (3.86±0.12 g/L) 比pDXW-8空载菌 (2.11±0.21 g/L) 提高了82.9%，而ppnK组成型表达菌的L-异亮氨酸产量 (2.99±0.18 g/L) 比pDXW-9空载菌 (2.11±0.23 g/L) 提高了41.7%，且分别比出发菌 JHI3-156 (2.08±0.20 g/L) 提高了85.6%和43.8%，说明通过表达ppnK基因来提高胞内NADP+和NADPH的供应有利于L-异亮氨酸的积累。与空载菌和出发菌相比，ppnK表达菌的糖酸转化率也显著提高，尤其是ppnK诱导表达菌 (0.0719 g/g) 比出发菌 (0.0377 g/g)和空载菌 (0.0370 g/g) 分别提高了 90.7%和94.3%，而ppnK组成表达菌 (0.0534 g/g) 比出发菌和空载菌 (0.0358 g/g) 分别提高了 41.6%和49.2%。ppnK表达菌的异亮氨酸产率 (异亮氨酸产量/细胞干重) 也得到一定程度的提高。ppnK诱导表达菌为 0.289 g/g，组成表达菌为0.222 g/g，都比出发菌JHI3-156 (0.142 g/g) 有了较大的提高，但与对应的空载菌 JHI3-156/pDXW-8 (0.223 g/g) 和 JHI3-156/pDXW-9(0.201 g/g) 相比，提高幅度分别降至 29.6%和10.4%，这与空载菌生长速率较慢有关。

3 结论

本研究构建了 2个重组质粒 pDXW-8-ppnK和pDXW-9-ppnK以及4株重组乳糖发酵短杆菌JHI3-156/pDXW-8，JHI3-156/pDXW-9，JHI3-156/pDXW-8-ppnK和JHI3-156/pDXW-9-ppnK。摇瓶发酵时，虽然2株空载菌的生长速率略微降低，但2株ppnK基因表达菌的菌体生长状态良好，说明 NAD激酶的表达有利于细胞的生长。与JHI3-156/pDXW-8相比，ppnK诱导表达菌的胞内 ATP-NAD+激酶的酶活提高了 83.5%，发酵24 h时胞内NADP+浓度提高了80.9%，NADPH浓度提高了21.7%，辅酶Ⅱ与辅酶Ⅰ的比例提高了63.8%，最终L-异亮氨酸产量提高了82.9%。与JHI3-156/pDXW-9相比，ppnK组成型表达菌的胞内ATP-NAD+激酶的酶活提高了2.20倍，发酵24 h时胞内NADP+浓度提高了88.0%，辅酶Ⅱ与辅酶Ⅰ的比例提高了 1.34倍，最终 L-异亮氨酸产量提高了41.7%。2株重组菌的异亮氨酸产量、产率和得率都高于出发菌株。

这些结果表明，过量表达谷氨酸棒杆菌NAD激酶，能够提高发酵细胞内辅酶Ⅱ的含量，为L-异亮氨酸的合成提供更为充足的必需还原力，推动L-异亮氨酸积累，同时也抵消了负荷载体对细胞生长的不利影响。与ppnK的诱导表达相比，虽然ppnK的组成型表达更有利于辅酶Ⅱ的合成，但对 L-异亮氨酸合成的促进作用却不如前者，一部分原因可能在于外源基因的组成型表达对细胞正常代谢造成影响，因为菌体在不同的生长时期对辅酶Ⅱ的需求量是不同的，而辅酶Ⅱ与辅酶Ⅰ的比例也对发酵进程产生影响，组成型表达所产生的辅酶影响了菌体各个时期胞内辅酶含量平衡，影响了细胞内的代谢流向。

而本研究证明在细胞快速生长到一定程度后再过量表达NAD激酶，有助于产生的辅酶Ⅱ更多地被L-异亮氨酸合成途径所利用，从而达到更好的辅酶供应调控效果。说明在L-异亮氨酸合成时，虽然辅酶Ⅱ的积累有利于产量提高，但也应根据代谢途径对辅酶的形式和含量的动态需求，通过调整NAD激酶表达的强度和表达的阶段性等方面，来满足L-异亮氨酸积累时所需要的辅酶量。对此，未来将进行小试发酵罐的实验，测定在良好的发酵环境下，两株重组菌及对照菌株生长、糖耗和产酸的情况，并进行全面分析，希望能得到更有价值的结论。

本文报道了利用NAD激酶来提高乳糖发酵短杆菌的L-异亮氨酸产量。分析了诱导型和组成型表达NAD激酶对发酵菌株的生长，NAD激酶酶活，辅酶含量和氨基酸产量的影响。结果表明，通过过量表达辅酶Ⅱ合成关键酶，有助于提高NADP(H) 的供应，从而提高L-异亮氨酸产量，本研究为通过辅酶调控手段来提高合成途径中NADPH的供应，进而运用于氨基酸生产提供了一定的参考。

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Overexpression ofCorynebacterium glutamicumNAD kinase improves L-isoleucine biosynthesis

Xiaojing Huan1,2, Kun Li1,2, Feng Shi1,2, and Xiaoyuan Wang1,2

1State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu,China
2Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu,China

还晓静, 李坤, 史锋, 等. 谷氨酸棒杆菌 NAD 激酶的过表达对 L-异亮氨酸合成的促进作用. 生物工程学报, 2012, 28(9):1038−1047.

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Received:December 21, 2011;Accepted:March 15, 2012

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30870056).

Corresponding author:Feng Shi. Tel/Fax: +86-510-85329236; E-mail: shifeng@jiangnan.edu.cn

国家自然科学基金 (No. 30870056) 资助。