应用人工神经修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究①

王晓亮，杨朝阳，李晓光，张皑峰

应用人工神经修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究①

王晓亮，杨朝阳，李晓光，张皑峰

目的 观察应用复合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-壳聚糖导管修复大鼠周围神经损伤的效果。方法成年Wistar大鼠25只分为假手术组(n=10)、单纯损伤组(n=5)和人工神经修复组(n=10)。假手术组仅暴露坐骨神经5 mm，单纯损伤组暴露坐骨神经并切断，人工神经修复组以复合bFGF-壳聚糖导管桥接缺损。术后对实验动物的坐骨神经进行大体观察，对运动进行行为观察，以及组织化学和免疫组织化学方法评价神经再生情况和靶肌肉恢复情况。结果术后5周，与单纯损伤组相比，人工神经修复组运动功能有一定程度恢复。人工神经修复组再生的坐骨神经已经通过bFGF-壳聚糖导管越过缺损并与远端相连接。免疫组织化学方法显示，坐骨神经再生段可观察到神经微丝(NF)阳性和S-100阳性纤维。应用Masson染色方法，可观察到人工神经修复组腓肠肌去纤维化程度相对于单纯损伤组有明显改善。结论应用bFGF-壳聚糖导管能有效修复周围神经损伤并使大鼠运动功能得到改善。

周围神经损伤；人工神经移植；神经再生；碱性成纤维细胞生长因子；壳聚糖；功能恢复

周围神经损伤是临床外科常见的疾病，会造成患者相关肢体的运动功能障碍和感觉功能缺失。临床治疗短距离周围神经损伤常施行端端吻合术，而治疗长距离周围神经损伤则采用自体或异体神经移植的方法。这些方法会对供体造成伤害，且异体移植会伴有免疫排斥的风险。近年来随着组织工程的发展，不断有学者尝试组织工程的方法构建人工神经来治疗周围神经缺损[1]。应用组织工程方法可以有效克服目前临床上治疗周围神经损伤的不足。组织工程化的人工神经通常包括能为施万细胞再生提供支架的桥梁以及促进神经轴索再生的成分。壳聚糖是一种来源于自然界的多聚糖，可通过人工控制其乙酰化程度来调节其降解速度，在医学和生物学领域都有极高的应用价值。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是具有有丝分裂源活性的阳离子多肽，具有保护神经元和促进神经再生的作用[2]。本次实验观察采用bFGF-壳聚糖导管构成的人工神经修复大鼠坐骨神经缺损。

1 材料和方法

1.1 材料 Wistar大鼠25只，体重200～220 g，由首都医科大学实验动物中心提供。随机分为假手术组(n=10)，单纯损伤组(n=5)和人工神经修复组(n=10)。主要试剂：小鼠来源抗大鼠神经微丝多克隆抗体(NF，SIGMA公司)、兔来源抗大鼠S-100蛋白(中杉金桥)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备 用6%水合氯醛腹腔内注射麻醉实验大鼠(30 mg/kg)，对左后肢备皮后固定于鼠板上，常规消毒。沿左侧股后部依次切开皮肤、皮下组织，分离半腱肌、半膜肌，暴露左侧坐骨神经主干并游离干净。

假手术组：暴露5 mm坐骨神经后不做任何处理，立即缝合肌肉和皮肤。

单纯损伤组：暴露坐骨神经后，切除坐骨神经造成5 mm缺损，待其自然回缩后，缝合肌肉和皮肤。

人工神经修复组：于股中部切除坐骨神经造成5 mm缺损，以7/0无创缝合针在手术显微镜下，将人工神经缝合于神经外膜上，并使两断端分别进入导管(导管长9 mm)内约2 mm，逐层缝合肌肉和皮肤。

1.2.2 取材及固定 术后5周分别对各组实验动物以4%多聚甲醛溶液经心脏灌注固定，游离并切取左侧坐骨神经相应再生段，同时取双下肢腓肠肌、比目鱼肌和趾长伸肌。所取组织经蔗糖梯度脱水后，将新生的神经组织和对照组相应神经干沿长轴方向纵向恒冷箱切片，切片厚12 μm；取腓肠肌标本中部，恒冷箱切片，切片方向垂直肌纤维走行，切片厚16 μm。

1.2.3 免疫组织化学染色 神经组织切片经PBST洗3次，每次5 min，入5%羊血清封闭30 min后，进行S-100和NF双重免疫组织化学染色。小鼠抗NF滴度为1∶50，兔抗S-100滴度为1∶100，一抗72 h后，分别加入Texas-red标记的山羊抗鼠IgG荧光二抗(Jakson公司)和Cy2标记的山羊抗兔IgG荧光二抗(Jakson公司)，滴度均为1∶100，室温避光过夜，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.2.4 组织化学染色 取各组腓肠肌中段横切片，入Masson复合染液10 min，0.2%醋酸稍洗，5%磷钨酸分色5 min后入0.2%醋酸浸洗3 min，入苯胺蓝溶液5 min，0.2%醋酸水洗两次，每次3 min，常规脱水透明封片。光镜下观察肌肉横截面及纤维化情况。

1.2.5 靶肌肉肌纤维面积比较 应用Image-pro plus 6.1计量并比较靶肌肉肌纤维横截面积。

1.3 统计学分析 数值以(xˉ±s)表示，采用SPSS 16.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 术后大体观察 术后1周时，单纯损伤组和人工神经修复组大鼠均出现术侧足不能跖屈。术后5周时，单纯损伤组大鼠术侧足仍不能跖屈，足趾有缺损并有趾甲缺失，足底可见溃疡形成；人工神经修复组大鼠也出现足趾破损，但程度较轻。假手术组大鼠均未见肢体损伤。将大鼠置于直径1.5 m的圆形区域内，任其自然行走，可观察到单纯损伤组大鼠在行走过程中，由于跖屈障碍术侧肢体不能参与运动，行走动作不协调，静止状态时可见足外翻畸形(图1B)。人工神经修复组大鼠术侧肢体能够参与到行走动作中(图1C)，但相对于假手术组(图1A)幅度较小。

造模时人工神经修复组经人工神经桥接后，可见损伤远近端均已被套接入壳聚糖导管内(图2)。对大鼠灌流取材后可见单纯损伤组的神经残端与周围组织粘连，界限不清，损伤末端形成膨大瘤状物(图3A)。人工神经修复组再生神经已经越过导管，并与远端相连(图 3B)。

图1 术后5周三组运动能力大体观察

2.2 再生神经的免疫组织化学染色 分别以神经微丝(NF200，红色)和S-100(绿色)蛋白作为周围神经轴突和髓鞘的标志物，假手术组两种纤维呈波浪型，纤维数量多，排列密集(图4A和B)。人工神经修复组神经再生段有大量的NF免疫阳性纤维和S-100免疫阳性纤维，其走行多与神经长轴平行，但连续性略差(图4D和E)。S-100是周围神经髓鞘特异性蛋白，人工神经修复组和假手术组的合成图中均可见到有S-100阳性纤维包绕NF阳性纤维(图4C和F)，说明人工神经修复组有髓神经纤维成功再生，但相对于假手术组，神经纤维数略少。人工神经修复组神经再生段可见NF纤维和S-100纤维的近管壁侧相对管中央侧密集而且直径较粗，而假手术组两种阳性纤维分布都很均匀。

2.3 相应靶肌肉的Masson染色 Masson染色可用来鉴别肌纤维(红色)和胶原纤维(蓝色)。在假手术组中，肌束横断面染色鲜艳，分布均匀，肌纤维呈多边形，肌纤维边缘及间隙无胶原纤维沉积(图5A)。单纯损伤组中，由于失神经性萎缩，肌纤维相对于假手术组染色黯淡，面积缩小且多呈梭形，肌纤维边缘和间隙可见蓝色胶原组织沉积(图5B)。在人工神经修复组中，可见肌纤维相对于单纯损伤组横截面积有明显增大，染色较鲜艳。但相对于假手术组，肌纤维面积未完全恢复，肌纤维间隙中，尚有部分胶原纤维沉积(图5C)。对各组肌纤维横截面积进行统计分析，单纯损伤组的肌纤维横截面积(174.27±85.03)μm2与人工神经修复组(615.8±314.2)μm2有显著性差异(P＜0.05)。

图4 人工神经修复组和假手术组NF和S-100免疫组织化学观察

图5 术后5周对各组靶肌肉的Masson染色

3 讨论

周围神经损伤后能否实现成功再生，与损伤局部对轴突的接触引导作用，神经趋化性和再生微环境等因素密切相关[3]。在本次研究中，我们采用了有良好生物相容性，可被机体降解的天然生物活性材料壳聚糖作为导管，使之在周围神经再生过程中，为施万细胞的再生提供支架从而起到桥梁作用，并且该材料制成的导管具有一定通透性，有利于神经导管和周围环境的营养物质交换[4-5]，有利于新生血管的生长。bFGF最初被发现能够促进原代成纤维细胞分裂增殖故而命名。现在发现bFGF具备有丝分裂原活性，也可加强施万细胞增殖；具有神经营养作用，能够保护受损的神经元，维持神经元的再生与存活，并促进周围神经轴突的生长。外源性应用bFGF可以提高再生轴突的密度、直径及髓鞘形成的质量。bFGF在生物体内半衰期很短，通过将bFGF与导管相结合，使bFGF缓释到壳聚糖导管内，能够在周围神经再生过程中持续发挥保护神经元和促轴突再生的作用。已有临床试验证实，bFGF的缓释给药效果明显优于一次给药。

在本次实验中，我们将bFGF以物理方式结合到壳聚糖导管上，并应用该结构的人工神经桥接修复坐骨神经5 mm缺损。通过大体观察可见，在术后1周时，人工神经修复组和单纯损伤组的实验动物术侧肢体均出现跖屈功能障碍、足底破溃、趾甲缺失等运动和感觉功能损伤。随时间延续，人工神经修复组运动和感觉神经再生，使跖屈功能障碍得以恢复，随着感觉功能和自主神经功能恢复，实验动物能够躲避伤害性刺激，肢体破溃逐渐愈合，趾甲复原。在术后5周时，通过对运动能力的观察发现，人工神经修复组大鼠术侧肢体跖屈功能接近假手术组，术侧足底破溃愈合，说明通过人工神经修复治疗，大鼠后肢的运动和感觉功能均得到明显改善。

周围神经的传导功能主要通过神经束内的轴突和包绕在轴突外面的髓鞘实现[6]。在术后5周，对各组实验动物进行灌流取材后，可看到人工神经修复组导管内再生神经已越过缺损处，并与远端连接，导管内尚有凝胶状的bFGF-壳聚糖载体存留。本次实验中，我们分别用NF和S-100蛋白特异性标记周围神经的轴突和髓鞘[7-8]。修复后5周观察到，两种标记物在再生段神经中都有免疫阳性表达，人工神经修复组的两种纤维主要分布于靠近导管壁一侧，粗细不一，排列密集；部分NF纤维可以被S-100纤维包绕，说明再生段中有髓神经纤维能够成功再生。但同时也可看到人工神经修复组再生的NF纤维相对假手术组略少。

再生神经对运动功能的影响最终体现于靶肌肉[9]。当周围神经被离断后，由于传导功能障碍，肌纤维由于失去神经的营养作用，靶肌肉会发生一系列变化，最终形成废用性萎缩，导致肌纤维数目下降，体积减少，胶原纤维增生。通过Masson染色可以观察到，假手术组肌纤维横截面积变小，呈梭形，肌纤维边缘有胶原蛋白沉积。而人工神经修复组的肌纤维，随着神经的再支配，肌纤维面积增大，胶原蛋白减少，但与假手术组尚有差距。对肌纤维的形态学观察说明，伴随着神经的再生，其靶肌肉接受神经营养的作用，并且得到再支配后其运功功能得到改善，与之前观察到的运动能力恢复可相互印证[10]。

本次实验通过对实验动物的术侧肢体大体观察、运动能力观察、再生神经和靶肌肉的形态学评价等方法，均可证明复合bFGF-壳聚糖载体的人工神经能够有效促进周围神经再生，并使修复治疗后的靶肌肉形态得到恢复，使得肌容积增加，最终促进靶肌肉运动功能的恢复。提示应用复合bFGF-壳聚糖导管的人工神经修复周围神经损伤具备临床研究和应用价值。

[1]李晓光,杨朝阳,张皑峰,等.应用壳聚糖导管-生物活性载体系统修复大鼠脊髓损伤[J].中国康复理论与实践,2003,9(3):176-178.

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Experimental Study on Sciatic Nerve Injury Repairing by Artificial Nerve Graft in RatsW

ANG Xiao-liang,YANG Zhao-yang,LI Xiao-guang,et al.Neuroscience Research Institute of Capital Medical University,Key Laboratory of Beijing Neuroregeneration Repair Research,Key Laboratory of Neural Degeneration of Ministry of Education,Beijing 100069,China

ObjectiveTo observe the effect of the chitosan tube combined with basic fibroblast growth factor(bFGF)on repairing sciatic nerve injury in rats.Methods25 adult Wistar rats were divided into modeled sham-operated group(n=10),lesion control group(n=5)and experiment group(n=10).All of them were operated with a 5-mm sciatic nerve exposed on the left.The lesion control group was intervened with the sciatic nerve cut off.The experiment group was intervened with bFGF-chitosan tubes bridged into nerve stumps.The movement behavior was observed,the regeneration of the injury nerves and the distal target muscle were detected by morphological staining.Results5 weeks after operation,the movement function of the experiment group was apparently recovered and gaps on the sciatic nerve were connected by the regeneration nerve in this group and NF and S-100 immunoreactive fibers were observed in regeneration nerve.Masson's trichrome stain showed that the target muscle was close to the level of sham-operated group in morphology and density.ConclusionThe chitosan tube combined with bFGF can repair the peripheral nerve injury effectively and improve the movement function of rats.

peripheral nerve injury;arti fi cial nerve graft;nerve regeneration;basic fibroblast growth factor;chitosan;function recovery

[本文著录格式]王晓亮，杨朝阳，李晓光，等.应用人工神经修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究[J].中国康复理论与实践,2012,18(6):535-538.

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.06.011

1.国家863项目(2006AA20A129)；2.北京市自然科学基金重点项目(D09080703660902)。

1.首都医科大学北京神经科学研究所，北京市神经再生修复研究重点实验室，教育部神经变性病学重点实验室，北京市100069；2.北京市友谊医院口腔科，北京市100050。作者简介：王晓亮(1983-)，男，河北三河市人，硕士研究生，主要研究方向：应用组织工程方法修复周围神经损伤。通讯作者：李晓光。

R651.3

A

1006-9771(2012)06-0535-04

2012-02-20

2012-03-29)

·综述·