不同剂量FTY720对大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3表达及细胞凋亡的影响①

杨梁，吕德成，郑连杰，王朝晖，张伟，李晓天

不同剂量FTY720对大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3表达及细胞凋亡的影响①

杨梁1，吕德成2，郑连杰1，王朝晖1，张伟3，李晓天3

目的 比较不同剂量FTY720对大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3的表达及神经细胞凋亡的影响。方法雌性SD大鼠200只，随机分为5组，每组40只。A组大鼠不打击脊髓，缝合切口后立即以0.3 ml生理盐水灌胃。B、C、D、E组大鼠制作Allen's T9脊髓损伤模型。B组造模后立即以0.3 ml生理盐水灌胃，C、D、E组分别以FTY720按1 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg生理盐水稀释至0.3 ml灌胃。分别于术后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取损伤段脊髓超薄切片，行SP免疫组化染色观察Caspase-3表达及TUNEL染色观察细胞凋亡情况，并计算相应时间点免疫组化学染色阳性细胞比值。结果A组各时间点几乎见不到Caspase-3和细胞凋亡阳性表达。B、C、D、E组均在伤后6 h开始出现凋亡细胞表达，伤后24 h达高峰，伤后48 h开始减弱，伤后72 h进一步减少。伤后各时间点细胞凋亡表达均为B组＞C组＞D组=E组(P＞0.05)＞A组(P＜0.05)。Caspase-3表达与细胞凋亡同步。相关性检验显示B、C、D组中，FTY720的剂量与Caspase-3表达、细胞凋亡表达呈负相关(P＜0.05)。D组和E组中，FTY720剂量与上述指标不相关(P＞0.05)。结论FTY720可以显著减少大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3的表达及神经细胞凋亡。FTY720的剂量与其减轻Caspase-3表达和细胞凋亡效果之间存在一定量效关系。3 mg/kg是FTY720治疗大鼠急性脊髓损伤的最适剂量。

FTY720；Caspase-3；凋亡；脊髓损伤；神经再生；剂量；量效关系

FTY720是一种来源于冬虫夏草的新型免疫抑制 剂[1]，因其毒副作用小，具有良好的临床应用前景。目前对FTY720的研究主要集中于器官移植和自身免疫性疾病的治疗[2-3]。近来发现FTY720对脊髓损伤有效[4]，在我们先前的研究中证实FTY720可以减轻大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3的表达及神经细胞凋亡[5]。但是对于FTY720的剂量与脊髓保护作用之间是否存在量效关系，以及FTY720治疗脊髓损伤的最适剂量方面还缺少相关研究。本次实验旨在比较不同剂量FTY720对大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3的表达及神经细胞凋亡的差别，了解FTY720的剂量与治疗效果之间是否存在量效关系，摸索FTY720治疗大鼠急性脊髓损伤的最适剂量，为临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂 雌性SD大鼠200只，体重180～220 g，由大连医科大学动物实验中心提供[合格证编号：SCXK(辽)2008-0002]。FTY720：武汉远城科技发展有限公司；Caspase-3抗体Caspase3(CPP32)Ab-4： 美 国 NeoMarkers For Lab Vision Corporation；TUNEL试剂盒：德国Roche Diagnostics GmbH Mannheim；SP试剂盒(即用型，内含H2O2、5%羊血清、羊抗兔多克隆抗体、过氧化物酶)：北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 脊髓损伤模型制作及实验分组 大鼠称重后，随机分为A、B、C、D、E 5组，每组40只。以2%水合氯醛60 mg/kg腹腔内麻醉、固定、消毒，切除T9棘突及椎板。A组(假手术组)大鼠不打击脊髓，缝合切口后立即以0.3 ml生理盐水灌胃。B、C、D、E组大鼠以Allen's动物脊髓打击器制作脊髓损伤模型，打击能量5 g×5 cm，打击面积2.5×1.5 mm，打击后大鼠迅速出现摇尾反射，双后肢及躯体回缩扑动，双后肢呈迟缓性瘫痪表明造模成功。B组造模后立即以0.3 ml生理盐水灌胃，C、D、E组造模后分别立即以FTY720按1 mg/kg、3 mg/kg、5mg/kg生理盐水稀释至0.3 ml灌胃。术后各组大鼠分笼饲养，定时按压下腹部促进排尿。

1.3 取材及切片制备 各组实验大鼠分别于术后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取材，每个时间点8只。2%水合氯醛(60 mg/kg)腹腔内麻醉大鼠，以含4%多聚甲醛的0.1 mol/L pH7.4 PBS液50 ml心脏灌注，取损伤区为中心损伤段脊髓长约1 cm，并从损伤区中心切为两段，任取一段置于4%多聚甲醛0.1 mol/L pH7.4 PBS液中固定24 h，石蜡包埋，连续切片，切片厚度4 μm，每隔10张切片取两张(一张用于免疫组化，另一张用于细胞凋亡染色)，每份标本共取10张切片，备用。

1.4 检测指标

1.4.1 SP免疫组化检测Caspase-3 切片脱蜡，0.01 mol/L PBS 冲洗 3 min，共 2次，3%H2O2室温 10～15 min，以消除内源性过氧化物酶，0.01 mol/L PBS冲洗3 min，共2次，0.01 mol/L CB缓冲液pH6.0微波修复100℃10 min，自然冷却后取片，0.01 mol/L PBS冲洗3 min，共2次，加5%羊血清蛋白封阻，室温10～15 min，倾去，加兔抗Caspase-3多克隆抗体(1∶50)，4℃过夜(18 h以上)，0.01mol/L PBS冲洗3 min，共3次。加羊抗兔多克隆抗体(即用型)，37℃15～20 min，0.01 mol/L PBS冲洗3 min，共3次，加过氧化物酶37 ℃ 15～20 min，0.01 mol/L PBS 冲洗 3 min，共 3次，DAB显色5～10 min，流水冲洗10 min，苏木精复染10 s，脱水、透明、封固[7-8]。

切片摄片后，将图像输入计算机，每张切片选取5个不重复脊髓损伤区域高倍视野图像，使用Image-pro plus 6.0医学图像分析系统分别计数免疫组化阳性细胞数和细胞总数，计算Caspase-3表达阳性细胞数与细胞总数的比值(每个标本Caspase-3表达阳性细胞数/每个标本细胞总数×100%)。

1.4.2 TUNEL染色细胞凋亡检测 切片脱蜡，0.01 mol/L PBS冲洗5 min，3%H2O2室温10 min，以消除内源性过氧化物酶，0.01 mol/L PBS冲洗5 min，共2次，0.01 mol/L CB缓冲液(pH 6.0)200 ml中，微波修复1 min，加入80 ml双蒸水，自然冷却，0.01 mol/L PBS冲洗5 min，加5%羊血清蛋白封阻，室温30 min，0.01 mol/L PBS冲洗5 min，共2次，加TUNEL反应液，37℃避光1 h，0.01 mol/L PBS冲洗5 min，共3次，避光，多功能显微镜观察免疫荧光阳性表达，并摄片，加POD 37℃30 min，0.01 mol/L PBS冲洗5min，共3次，DAB显色5～10 min，流水冲洗10 min，苏木精复染3 s，流水返蓝10 min，脱水、透明、封固[9-10]。

将TUNEL染色图像输入计算机，每张切片选取5个不重复脊髓损伤区域高倍视野图像，Image-pro plus 6.0医学图像分析系统分别计数TUNEL染色阳性细胞数和细胞总数，计算每个标本细胞凋亡指数(TUNEL阳性表达细胞数/每个标本细胞总数×100%)。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。多组比较采用单因素方差分析，LSD法多重组间比较，相关性检验采用Pearson检验，P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果

200 只大鼠均进入最终结果分析。E组大鼠在造模后1 d有2只出现血尿。

2.1 Caspase-3的表达 大鼠急性脊髓损伤后，脊髓损伤区的Caspase-3阳性细胞数量随时间增加，至24 h达到高峰，而后随时间下降。经FTY720治疗的大鼠个别细胞在损伤后6 h即表达Caspase-3，12～24 h Caspase-3阳性细胞数量达高峰，而后随时间下降，72 h恢复至正常水平。急性脊髓损伤大鼠在伤后24 h内Caspase-3表达主要集中在灰质区神经元，48～72 h神经元Caspase-3表达减少而损伤区周边的小胶质细胞胞浆表达Caspase-3增加。伤后6 h至48 h各时间点各组间Caspase-3表达阳性细胞比值两两比较均为B组＞C组＞D组=E组(P＞0.05)＞A组(P＜0.05)。伤后72 h A组和D、E组Caspase-3表达阳性细胞比值无显著性差异(P＞0.05)，均小于 B、C 组(P＜0.05)。可见FTY720可以减少脊髓损伤后细胞内Caspase-3表达，并缩短Caspase-3表达的时间。Caspase-3阳性表达细胞呈黄褐色。见表1、图1。

表1 Caspase-3表达阳性细胞数比例(%)

2.2 细胞凋亡

2.2.1 TUNEL染色结果 TUNEL染色观察A组各时间点几乎见不到凋亡细胞。B、C、D、E组均在伤后6 h开始出现凋亡细胞表达，伤后24 h达高峰，伤后48 h开始减弱，伤后72 h进一步减少。伤后各时间点细胞凋亡表达均为B组＞C组＞D组=E组(P＞0.05)＞A组(P＜0.05)。各组伤后24 h以前凋亡细胞表达主要集中在灰质区的神经细胞，胞核明显黄染，染色依时间逐渐加深；伤后48 h及72 h，神经元细胞凋亡减少而损伤区周边的小胶质细胞凋亡增加。见表2、图2。

表2 各组凋亡指数(%)

2.2.2 TUNEL染色过程中的免疫荧光结果 免疫荧光结果同TUNEL染色结果一致。免疫荧光及TUNEL免疫组化染色结果均显示FTY720可以明显减少脊髓损伤后的细胞凋亡。见表3、图3。

表3 各组免疫荧光阳性细胞数量

相关性检验显示，B组(0 mg/kg)、C组(1 mg/kg)、D组(3 mg/kg)中，FTY720的剂量与Caspase-3表达(r=-0.606,P＜0.05)、细胞凋亡表达(r=-0.553,P＜0.05)呈负相关。D组(3 mg/kg)和E组(5 mg/kg)中，FTY720剂量与Caspase-3表达(r=0.052,P＞0.05)、细胞凋亡表达(r=0.017,P＞0.05)无相关性。

图1 脊髓损伤24 h Caspase-3 表达(SP 免疫组化染色，400×)

图2 脊髓损伤24 h细胞凋亡结果(TUNEL 染色，400×)

图3 凋亡细胞(TUNEL 染色过程中的免疫荧光，200×)

3 讨论

本实验的结果显示，C、D、E三组各时间点Caspase-3表达和细胞凋亡均低于B组(P＜0.05)，进一步证实FTY720可以减少大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3表达和细胞凋亡。

同时本实验的结果还显示，B、C、D三组，随着FTY720的剂量由0 mg/kg增加至3 mg/kg，各组各时间点Caspase-3表达、细胞凋亡表达均逐渐下降(P＜0.05)。D组和E组之间，随着FTY720的剂量由3 mg/kg增加至5 mg/kg，两组各时间点上述指标之间无显著性差异(P＞0.05)。并且E组(5 mg/kg)出现血尿等副反应。

相关性检验显示，B组(0 mg/kg)、C组(1 mg/kg)、D组(3 mg/kg)中，FTY720的剂量与Caspase-3表达、细胞凋亡表达之间呈负相关(P＜0.05)。D组(3 mg/kg)和E组(5 mg/kg)中，FTY720剂量与上述指标不相关(P＞0.05)。说明FTY720的剂量与其减轻Caspase-3表达和细胞凋亡效果之间存在一定量效关系。3 mg/kg是FTY720治疗大鼠急性脊髓损伤的最适剂量。在剂量小于3 mg/kg时，随着FTY720剂量的增大，其减轻Caspase-3表达和细胞凋亡效果作用越强；在剂量大于3 mg/kg时，再增加剂量，其减轻Caspase-3表达和细胞凋亡效果不再增加，反而增加了副反应。

FTY720主要通过抑制淋巴细胞从次级淋巴组织中游出和在胸腺积极竞争S1P受体，使外周循环的淋巴细胞进入淋巴结，从而减少外周血淋巴细胞计数，来发挥其功能的[11]。我们推断产生这种量效关系的原因可能是，大鼠急性脊髓损伤后，使用3 mg/kg的FTY720治疗，已经达到抑制淋巴细胞浸润的极致，再增加剂量不能增加其对淋巴细胞的抑制作用，从而不能进一步保护脊髓功能。

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Effects of Different Doses of FTY720 on Expression of Caspase-3 and Neural Apoptosis in Rats with Acute Spinal Cord Injury

YANG Liang,LÜ De-cheng,ZHENG Lian-jie,et al.Department of Orthopaedics,Second Affiliated Hospital,Dalian Medical University,Dalian 116027,Liaoning,China

ObjectiveTo compare the effects of different doses of FTY720 on inhibiting expression of Caspase-3 and neural apoptosis in rats with acute spinal cord injury(SCI),and find out the suitable dose.Methods200 female SD rats were randomly divided into 5 groups with 40 in each group.Group A(laminectomy but not contusion)were administered 0.3 ml normal saline by gavage.SCI model was established by Allen's WD method at the T9level of spinal cord in other groups.Group B were administered 0.3 ml normal saline after modeling.Groups C,D and E were administered 0.3 ml FTY720-saline solution of 1,3 and 5 mg/kg respectively.All the groups were sacrificed at 6 h,12 h,24 h,48 h,72 h(n=8,per each time-point).Caspase-3 expression was detected with streptavidin-peroxidase immunohistochemistry,and neural apoptosis was detected with the TUNEL method.ResultsPositive Caspase-3 expression and neural apoptosis were not observed in Group A at 6 h.In Groups B、C、D and E,the number of apoptotic cells increased with increased time of acute SCI,peaked at 24 h after injury,and then gradually reduced.Caspase-3 expression was at equal pace with neural apoptosis.The difference of the number of apoptotic and Caspase-3 expression cells among all groups were significant,with the order Group B＞Group C＞Group D＞Group A(P＜0.05).However,there was no significant difference between Group D and Group E(P＞0.05).The number of apoptotic and Caspase-3 expression cells negatively correlated with the dose of FTY720 when the dose was less than 3 mg/kg(P＜0.05),and there was no relationship when the dose was more than 3 mg/kg(P＞0.05).ConclusionFTY720 significantly reduces Caspase-3 expression and neural apoptosis in rats with acute SCI.There is a dose-effect relationship between the dose of FTY720 and the Caspase-3 expression and neural apoptosis.It's indicated that 3 mg/kg is the most appropriate dosage.

FTY720;Caspase-3;apoptosis;spinal cord injury;neural regeneration;dose;dose-effect relationship

[本文著录格式]杨梁，吕德成，郑连杰，等.不同剂量FTY720对大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3表达及细胞凋亡的影响[J].中国康复理论与实践,2012,18(6):530-534.

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.06.010

辽宁省教育厅资助课题(编号：L2010105)。

1.大连医科大学附属二院骨科，辽宁大连市116027；2.大连医科大学附属一院骨科，辽宁大连市116011；3.大连医科大学，辽宁大连市116021。作者简介：杨梁(1973-)，男，山东文登市人，医学博士，副教授，主要研究方向：脊柱外科。

R651.2

A

1006-9771(2012)06-0530-05

2012-02-14)

·临床研究·