葛根素对大鼠肝缺血再灌注损伤肾组织中SDH与LDH的影响

王旭林，王红梅，牟永华，梁 勇

葛根素对大鼠肝缺血再灌注损伤肾组织中SDH与LDH的影响

王旭林1，王红梅2，牟永华1，梁 勇2

目的：观察肝缺血再灌注损伤中肾组织中琥珀酸脱氢酶（SDH）、乳酸脱氢酶（LDH）的变化及葛根素预处理对其影响及机制。方法：建立肝缺血再灌注损伤动物模型，健康雄性SD大鼠32只随机分为假手术组、缺血再灌注组（I/R组）、葛根素预处理组（PUE组）和生理盐水预处理组（N组），应用HE染色观察肝、肾组织病理组织学改变，分光光度计法测定肾组织中SDH、LDH的活性变化。结果：PUE组肾小球系膜区上皮细胞部分肿胀，间质充血，未见明显上皮细胞坏死。I/R组SDH活性比对照组明显下降(P＜0.05)，PUE组与I/R组比较，SDH活性有差异(P＜0.05)，N组SDH活性与假手术组及PUE组比较，也有显著差异(P＜0.05)。I/R组LDH活性比对照组明显下降(P＜0.05)，PUE组LDH活性比I/R组明显升高(P＜0.05)。结论：肝缺血再灌注损伤可引起肝、肾组织形态结构改变，其造成能量代谢障碍是导致肾损伤的主要病理生理基础之一，葛根素可通过改善肾组织能量代谢而减轻肾组织的损伤。

肝缺血再灌注损伤；葛根素；肾组织；琥珀酸脱氢酶；乳酸脱氢酶

肝缺血再灌注损伤作为外科常见的病理生理过程，不仅影响肝脏本身的功能，对远隔器官也同样产生损伤[1]。药物预处理在缺血再灌注损伤中的保护作用正逐渐被人们关注[2]。本研究旨在探讨葛根素预处理在肝缺血再灌注损伤中对肾功的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 选健康雄性SD大鼠32只,体质量（200±10）g,浙江省医学科学院实验动物中心提供。采用数字随机表法随机分为假手术组、缺血再灌注组(I/R组)、葛根素预处理组（PUE组）和生理盐水对照组(N组)，每组8只。

1.2 实验方法 实验前12 h禁食，乙醚浅麻醉，清洁大鼠，取上腹部正中切口入腹，钝性分离肝门部。假手术组：不做进一步处理。I/R组：用无创血管夹夹闭肝门部血管30 min，造成100%实质性肝缺血，在夹闭肝门部血管30 min后去除血管夹使肝脏血流恢复，在I/R后6 h处死大鼠。PUE组和N组：在缺血前15 min分别从尾静脉缓慢推注PUE(100 mg/kg体质量)和生理盐水(100 mg/kg体质量)，余操作同I/R组。在再灌注6 h时处死大鼠并取材。缺血期间及再灌注后均关腹，全部手术过程均为无菌操作。

1.3 试剂

1.3.1 琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.3.2 葛根素注射液 浙江康恩贝制药股份有限公司生产(100 mg/2 mL，amp)。

1.4 指标检测

1.4.1 肝、肾组织HE染色 各组分别取肝、肾组织，常规HE染色，观察肝组织、肾组织形态学改变。每只大鼠肝、肾切片随即选取20个视野观察，根据Camargo等[3]评估肝组织损伤指数方法，将肝组织损伤分为4级：0级：很少或没有证据表明损伤；1级：肝脏轻度损伤，胞质空泡、局灶性核固缩；2级：中度到重度损伤，广泛的核固缩，细胞间隙脱落，中至重度中性粒细胞浸润；3级：肝脏重度损伤，肝索断裂、出血、重度中性粒细胞浸润。根据肾小管坏死程度，采用Rabb等[4]的半定量病理评估法评分：评分越高说明肾小管坏死越严重（最高4分），0分：正常肾脏；1分：最少坏死（<5%的肾小管坏死）；2分：轻度坏死（5%～25%的肾小管坏死）；3分：中度坏死（25%～75%的肾小管坏死）；4分：重度坏死（>75%的肾小管坏死）。

1.4.2 肾组织SDH、LDH的变化 按照SDH测试盒说明书操作用分光光度计分别测出反应5 s及65 s的OD值，根据公式计算出肾组织中SDH活性，组织中 SDH 活性=[OD5s－OD65s）/0.01]/反应时(min)与取样量中的蛋白毫克数(mg/mL)的比值；按照LDH测定试剂盒说明书操作用分光光度计测出空白管、标准管及每个样品测定管、对照管的OD值，根据公式计算出肾组织中LDH活性。组织中LDH活性=（OD测定管－OD对照管）/（OD标准管－OD空白管）×2mM标准浓度与样本中蛋白浓度（g/mL）的比值。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件包处理数据，各实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较经方差齐性检验及方差分析后行q检验，以P＜0.05为显著性差异标准。

2 结果

2.1 肝、肾病理组织学观察 肝组织结构变化：假手术组肝组织中无中性粒细胞浸润，肝细胞排列整齐，肝界板完整，肝血窦清晰可见。I/R组肝细胞出现肿胀，部分严重者肝细胞呈气球样变，有局灶性坏死区，肝血窦受压明显，肝界板破坏，肝脏结构紊乱（见图1）。PUE组肝界板完整，肝细胞水肿，间质充血（见图2）。N组部分肝细胞有局灶性碎片样坏死区，肝界板破坏，肝脏结构紊乱。损伤等级评分（见表1）。

肾组织结构变化：假手术组肾组织细胞结构完整，未见组织细胞水肿及坏死现象。I/R组肾小球系膜区上皮细胞空泡变性明显、部分肿胀，间质充血，炎细胞浸润，甚至有个别上皮细胞坏死（见图3）。PUE组肾小球系膜区上皮细胞部分肿胀，间质充血，未见明显上皮细胞坏死（图4）。N组肾小球系膜区上皮细胞部分肿胀，间质充血，炎细胞浸润，有个别上皮细胞坏死。损伤等级评分（见表1）。

图1 I/R组肝组织可见肝细胞片状坏死（HE 40×）

图2 PUE组肝组织可见肝细胞轻度水肿，间质充血（HE 40×）

图3 I/R组肾组织可见肾小球上皮细胞空泡变性，间质水肿（HE 40×）

图4 PUE组肾组织可见肾小球上皮细胞部分肿胀，间质充血（HE 40×）

表1 各组肝肾组织损伤评估值分析(±s，n=8)

表1 各组肝肾组织损伤评估值分析(±s，n=8)

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与I/R组比较，bP＜0.05；与PUE组比较，cP＜0.05

肝组织损伤评分肾组织损伤评分假手术组0.22±0.44 0.31±0.67 I/R组1.78±0.83a 3.40±0.88a PUE组0.67±0.71b 2.01±0.76a、b N组1.64±0.76a、c 3.21±0.49a、c

2.2 肾组织SDH、LDH的变化 I/R组SDH活性比假手术组明显降低，PUE组SDH活性明显高于I/R组，N组SDH活性与假手术组及PUE组比较均有差异，I/R组LDH活性比对照组明显下降，PUE组LDH活性比I/R组明显升高（见表2）。

表2 各组肾组织SDH、LDH的变化(±s，n=8)

表2 各组肾组织SDH、LDH的变化(±s，n=8)

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与I/R组比较，bP＜0.05；与PUE组比较，cP＜0.05

SDH（u/mgprot）LDH（u/gprot）假手术组8.09±0.02 1292.33±223.03 I/R组4.55±0.03a 1021.58±640.02a PUE组7.29±0.03b 1250.48±180.04a、b N组5.56±0.07a、c 1087.52±175.05a

3 讨论

肝缺血再灌注损伤可引起再灌注性心率失常、脑功能、肾功能等许多脏器的损伤，甚至可引起全身多脏器功能损伤，我们以往的研究已证实肝缺血再灌注后可造成肾组织损伤[5]。本研究病理组织学观察到，在肝缺血再灌注形成肝组织损伤的同时，随着缺血再灌注的延长，肾小球及肾小管细胞可见水肿、充血表现，炎细胞浸润，甚至伴有细胞坏死，I/R组和N组中肝肾组织损伤评分值明显高于假手术组。进行缺血再灌注损伤的预处理，可明显减轻缺血再灌注时脏器的损伤程度，已逐渐引起临床医师的关注。

肝缺血再灌注后产生大量的氧自由基，激活肝枯否细胞，并经中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)介导，导致进一步扩大的损伤。肝缺血再灌注后，PMN在钙超载、氧自由基(oxygen free radicals,OFR)及细胞因子的作用下，趋化进入肝窦，与受损的肝内皮细胞黏附、活化，通过产生大量OFR及释放蛋白水解酶、炎性介质扩大损伤。大量OFR通过血液循环到达肾脏，可造成肾脏组织损伤，进一步引起肾功能障碍[6]。可能机制是，OFR可损伤血管内皮细胞，引起内皮细胞肿胀，管腔狭窄，严重时可阻塞肾血管，造成无复流现象。OFR还能使毛细血管通透性增加，血流浓缩，血液黏度升高，血细胞阻塞，加重肾血流动力学障碍[7]。也有研究报道，在自由基损伤的基础上，可能与肾素-血管紧张素-醛固酮系统有关[8]。我们的研究发现，肝缺血再灌注损伤不仅导致肾组织结构的改变，同时发现肾组织中SDH、LDH也出现相应变化，其活性较对照组明显降低。

SDH是三羧酸循环中与氧化磷酸化有关的一个重要酶，分布在线粒体内膜，作为线粒体的标志酶。它的活性反映三羧酸循环的功能。在肝缺血的初期，肝细胞通过快速的糖原分解和无氧酵解补偿能量的不足，这样细胞和亚细胞的结构和功能被维持。随着缺血时间的延长，ATP酶和糖原逐渐下降甚至耗尽，这会导致缺血细胞不可逆的损害。许多研究表明，肝缺血后复流，SDH的活性显著降低[9]。肝缺血再灌注后由于体循环血流动力学改变而累及到肾脏，导致肾脏的缺血缺氧，引起肾组织形态结构改变。组织缺氧最早期的变化发生在线粒体，肾缺血时常导致线粒体结构和功能变化，SDH易受到OFR和钙内流的破坏而减少或消失[10]。本实验中肾组织SDH在I/R组与对照组比较活性有明显降低，说明随着肾脏氧化损伤的加重，SDH的活性逐渐下降。能量循环障碍可能是导致肝缺血再灌注损伤引起肾损伤的另一发病机制之一。

LDH是一种糖酵解酶，是糖无氧代谢的关键酶。在组织缺氧情况下，通过无氧酵解，维持组织能量代谢。有报道，肾组织中LDH含量较心、肝、骨骼肌高，肝I/R后，机体调节机制建立，肝肾心脑等重要脏器中LDH活性增加[11]，以维持机体正常代谢生理功能。本实验结果发现，在肝缺血再灌注形成后，肾组织中LDH活性低于对照组。这主要是由于LDH是一组含巯基的酶，而再灌注后由于钙超载及OFR大量产生，OFR与肾组织细胞内LDH的巯基的亲和性较高，破坏了LDH的结构，而使其活性降低。

本实验在以往研究的基础上，使用中药葛根素做预处理，观察葛根素对肝缺血再灌注损伤肾的保护作用及机制。葛根素是从中药葛根中提取的一种异黄酮类化合物，目前已在临床上广泛地应用于肾病的治疗。很多研究证实，葛根素通过扩张血管、改善微循环、抗血小板聚集、降低血液黏滞度以及抗氧自由基等多重途径发挥肾保护的作用[12]。本研究结果表明，PUE组HE染色仅见肾小球、肾小管上皮细胞轻度水肿，未见明显气球样变，组织坏死灶。肝肾组织损伤评分明显低于I/R组及N组。同时，肾组织中SDH的活性明显高于I/R组，但与假手术组比较无显著差异。PUE组肾组织LDH的活性与I/R组比较，明显升高，与对照组比较，无显著差异。提示葛根素主要通过改善能量代谢，减轻肾组织损伤。

肝缺血再灌注损伤造成能量代谢障碍是导致肾损伤的主要病理生理基础之一。应用葛根素进行药物预处理，能明显改善能量代谢，减少肝缺血再灌注损伤对肾组织的损伤，提示对于防治肝缺血再灌注损伤引起的肾功能不全可能有潜在的临床应用价值。

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Effect of Puerarin on Activity of SDH and LDH in Renal Tissue after Liver Schemia-Reperfusion Inju⁃ ry in Rats

WANG Xu-lin,WANG Hong-mei,MOU Yong-hua,et al.Department of Hepatobiliary Surgery,Taizhou Municipal Hospital,Taizhou(318000),China

ObjectiveTo explore Protective effect of puerarin on activity of SDH and LDH in renal tissue after liver ischemia-reperfusion injury.MethodsA model of liver ischemia-reperfusion injury was estab⁃lished by imitation.32 healthy rats were randomly divided as following：the control group(the group of sham op⁃eration),reperfusion following ischemia 30 min(I/R group),Puerafin pretreatment group(PUE group),normal sa⁃line pretreatment group(N group).Liver tissue and renal tissue were detected by HE-staining.SDH and LDH were measured.ResultsLiver ischemia/reperfusion induced the remarkable renal cell injury.Eedma and infil⁃tration of inflammatory cells,in liver tissue,as well as nacrosis,were detected by HE-staining.Partly vacuolar de⁃generation was found in renal morphological changes.Then only mesangial cell edema were detected in PUE group.the contents of SDH were significantly decreased between I/R group and control group(P＜0.05)，remark⁃able increasing in PUE group(P＜0.01),the numbers of LDH were significantly decreased in I/R group,com⁃pared with PUE and control group.Conclusionrenal tissue injury is formed following the process of liver ischemia/reperfusion injury.The changes of SDH and LDH might be involved into the mechanism of renal cell injury.then Puerafin pretreatment have an protect effect on cardiac insufficiency by increasing SDH and LDH levels.

Hepaticischemia-reperfusion injury；Puerafin；Renal tussue；Succinate dehydrogenase；Lactate dehydrogenase

Q95-33；Q782

A

1007-6948(2012)03-0265-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.03.014

1.浙江省台州市立医院肝胆外科（台州 318000）

2.浙江省台州学院医学院病生教研室（台州 318000）

（收稿：2011-11-12 修回：2012-05-16）

（责任编辑 刘洪斌 屈振亮）