菊花的组织培养技术

肖志坚，纪 艳，刘德江，吴恒梅，罗志文

（佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯 154007）

菊花（Chrysanthemum）原产中国，为菊科（Asteraceae）菊属（Chrysanthemum）的多年生宿根草本植物，是世界著名的四大切花之一，具有极高的观赏价值。菊花品种繁多，花色各异，是公园花展和家庭装饰的主要花卉。目前菊花的繁殖一般采用扦插、分株等传统方法，以及组织培养、离体快繁、工厂化生产等高新技术，可在短时期内获得大量菊花种苗。笔者以菊花为材料，从培养基的制备，菊花外植体的选择、灭菌和接种等方面探讨了菊花的组织培养技术，以期为菊花在园艺植物工厂化生产中的应用提供理论依据。1 材料与设备

1.1 材料与试剂

选取无病毒、无病害、生长良好的菊花作为组织培养的材料，并准备制备MS培养基所需的试剂，如乙醇、1 mol/L 的 HCl、1 mol/L 的 NaOH、升汞、琼脂、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸(NAA)及蔗糖等。

1.2 设施与设备

菊花组织培养所需的设施有：培养基制备、灭菌和材料处理室、无菌接种室、组织培养室、种苗移栽培养室、培养架、花木栽培室（棚、阴棚、苗圃）。

菊花组织培养所需的设备仪器有：超净工作台或简易接种箱、高压灭菌锅、解剖刀、镊子、容量瓶、锥形瓶、培养皿、烧杯、封口膜、白线绳、牛皮纸、圆滤纸、解剖剪、天平。

2 最佳培养基的筛选

从多次的对比试验中筛选出下列培养基。

丛生芽诱导最佳培养基：MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

丛生芽继代最佳培养基：MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

最佳生根培养基：1/2 MS+0.1 mg/L NAA

3 培养基的制备

培养基配制过程为：

3.1 MS培养基母液的配制与保存

MS培养基母液包括：储备液I（大量元素母液）、储备液II（微量元素母液）、储备液III（有机成分母液）、储备液IV（铁盐母液）及植物激素母液（NAA母液和6-BA母液）。

储备液I～III的配制方法为：按照表1的配方将每种试剂先分别溶解，再彼此混合，最后定溶至所需数量。储备液IV的配制方法为：取FeSO4·7H2O5 566 mg和 Na2EDTA·2H2O 7 460 mg分别置于450 mL蒸馏水中，加热搅拌使之溶解，然后将2种溶液混合，再加蒸馏水至1L。

表1 储备液I～III的配方

植物激素母液的配制方法为：①0.1 mg/L NAA母液。称取10 mgNAA，用少量95%乙醇或少量乙酸溶解后，用蒸馏水定溶至100 mL。②10 mg/L 6-BA母液。称取100 mg 6-BA，用少量1 mol/mL的盐酸溶解后，用蒸馏水定溶至100 mL。然后根据所需功能的不同，在MS培养基中加入不同量的NAA和6-BA母液，具体加入量见表2。

最后，将配制的所有母液放入冰箱保存，特别应注意将储备液IV储存于棕色瓶中。

表2 各功能培养基中植物激素母液加入量 mL

3.2 培养基的配制与分装

1 L培养基的配制：分别取50 mL储备液I，5 mL储备液II，5 mL储备液III和5 mL储备液IV，1 mL NAA母液，2 mL 6-BA母液放入1 000 mL的烧杯中；另取1个烧杯（或不锈钢锅）加入700 mL蒸馏水、30 g蔗糖、7 g琼脂，加热使琼脂溶化，再将溶解的琼脂糖溶液倒入盛有各种母液的烧杯中，用蒸馏水定溶至1 L，混匀后测pH；用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节pH至5.8，最后将培养基分装到锥形瓶中。

诱导丛生芽和继代培养，取50 mL的锥形瓶，每瓶注入20 mL培养基；生根培养取100 mL锥形瓶，每瓶注入30 mL培养基；分装后用封口膜和线绳封口。

3.3 灭菌

待灭菌的物品有：培养基、无菌水和装有滤纸的培养皿。

具体灭菌步骤是：先将蒸馏水装入1 000 mL锥形瓶的3/4处，用封口膜和牛皮纸两层封口；再将装有滤纸的培养皿5个一包；然后，连同已分装好的培养基一起放入高压灭菌锅内，在1.2个大气压下灭菌10～15 min，冷却后备用。注意灭菌时间不得超过15 min，以免培养基变性。

4 菊花的组织培养技术

4.1 组培部位的选择

菊花可再生植株的器官有很多，如茎尖、茎段、侧芽、叶、花序轴、花瓣等。若以快速繁殖为目的，应采用茎尖和侧芽，其次是花序轴；若以育种为目的，则应采用花瓣；若以脱毒为目的，则必须用茎尖。

菊花的初代培养最好在9月进行。以花序轴为材料时，应选取具备该品种典型特征的饱满壮实的花蕾，最好是含苞待放的花蕾（内部无菌）。采摘后应做好表面灭菌，以便于无菌条件下剥离出花序轴，进而用于接种。

4.2 组培材料的灭菌

取开花前2～3 d将要开放的菊花花蕾，放入烧杯中，先用自来水冲洗10 min；然后在已灭菌的超净台上，用75%的乙醇浸泡30 s后，用无菌水冲洗2次，再用0.1%的升汞消毒10 min，用无菌水冲洗4～5次；最后放入已灭菌有滤纸的培养皿中，在无菌的条件下，进行剥离和接种。

4.3 接种

无菌接种前，应对无菌室进行全面消毒，包括超净台的灭菌及手的消毒（75%酒精棉消毒）。无菌接种过程应在酒精灯控制下进行。

具体接种步骤为：花蕾在培养皿中被滤纸吸干后，剥除花序轴外层花被，得到半球形的花序轴，把花序轴切成4块，每个锥形瓶放入2块，正面向上，封口后送进组培室。培养室的温度应保持在24～26℃，相对湿度应保持在60%～70%，每天应保证12 h的光照，光照强度约为1 500 Lx，也可使用自然光。3 d后外植体膨大，12 d后分化出芽，30 d后芽分化基本停止，当芽苗达2 cm时即可转瓶进行继代培养。

4.4 继代培养

继代培养4～5周为1次，增殖倍率均在5～10倍以上，继代次数在10次左右芽苗均较理想。继代5次后，选取一部分芽苗进行生根培养和移植栽培，另一部分芽苗继续继代增殖。

通过调整6-BA浓度控制芽苗的增殖倍率，前几次继代时，6-BA浓度可以高一些；接近选用芽苗生根时，6-BA的浓度可以低一些，使芽苗的增殖倍率下降，生长健壮，以利于生根和移栽。6-BA的添加范围为0.1～1.5 mg/L。

转接方法为：在无菌条件下，使用2个50 mL锥形瓶进行转接，用酒精灯控制瓶口，防止杂菌进入瓶中造成污染；将具有芽苗的锥形瓶打开，用解剖刀或剪刀切取1株芽苗接种至装有新培养基的锥形瓶中，每瓶接芽苗1株，封口后移至培养室中继续培养。培养条件与诱导培养时相同，光照强度可以提高一些。

4.5 生根与移栽

在增殖培养基中培养30 d，芽苗达3 cm时，将单株嫩芽切下，插入生根培养基中培养。生根培养使用100 mL的锥形瓶，以利于培养大苗壮苗。生根培养基中不加6-BA，因为6-BA利于生芽，NAA利于生根。一般培养2周，即可生根；生根培养4周，根长＞1 cm时，出瓶移栽。

移栽前，将芽苗生根的锥形瓶移至种苗移栽培养室内炼苗6 d，前3 d将瓶口打开一半，后3 d将瓶口完全打开，以使芽苗逐步适应培养室环境。另外，应准备培养箱和基质，培养箱长55 cm，宽37 cm，栽植的株行距为4 cm×6 cm；基质的成分为田园土、沙、腐叶及腐熟的猪粪，比例为5︰2︰2︰1，并经暴晒消毒；培养室温度控制在24～26℃，相对湿度控制在80%左右，适当遮阳。

移栽时，用镊子将小苗轻轻取出，在清水中将依附于小苗根部的培养基洗净，轻轻栽于培养箱的基质中；使用小型营养钵，每钵1株，栽后放置于架上培养；栽后开始阶段覆膜保湿；移栽7 d后，芽苗即可成活；当苗长到一定大小时，根据生产目的移至棚、室或花圃进行栽培管理。

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