CD133阴性胶质瘤干细胞的研究现状☆

黄宁陈松程远

CD133阴性胶质瘤干细胞的研究现状☆

黄宁*陈松*程远*

胶质瘤 肿瘤干细胞 CD133 胶质瘤干细胞

肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）假说认为：肿瘤中存在一组特殊的细胞亚群，虽然它们所占比例极小，但却是肿瘤无限增殖、高侵袭及多药耐药的源泉。CSCs的分离和生物学特征的验证对肿瘤产生、发展及转归的观念产生了重大影响。目前已在白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌等肿瘤中分离并证实了CSCs的存在。在胶质瘤中已分离出CD133（＋）肿瘤细胞，它们类似于神经干细胞（neural stem cells，NSCs），具有很强的自我更新能力，能够形成肿瘤球，并在NOD／SCID鼠的原位种植中成瘤。CD133作为胶质瘤干细胞（glioma stem cells，GSCs）标记物的观点已被接受，但近年来研究证实有一小群CD133（－）胶质瘤细胞也具有干细胞特征，动摇了CD133作为检验GSCs“标准”的地位。本文将对CD133（－）GSCs存在依据、与CD133（＋）GSCs相互关系、CD133（－）GSCs探索的局限性以及CD133（－）GSCs标志物研究进展进行综述。

1 CD133（－）GSCs存在依据

“肿瘤球”、多潜能分化、单细胞克隆、致瘤性及干细胞标记物已成为了鉴定CSCs的必备条件，然而近年来发现在胶质瘤中存在具有上述特点的CD133（－）细胞亚群。

1.1 形态学 NSCs或CD133（＋）GSCs的生长方式均为“球形聚集”。在胶质瘤中用流式细胞技术或免疫磁珠分选出CD133（＋）细胞后，剩余的CD133（－）肿瘤细胞仍可形成“肿瘤球”［1］；此外在部分原代胶质瘤中无法检测到CD133（＋）肿瘤细胞，而0.5%～2%的 CD133（－）肿瘤细胞也能聚集成球形生长［2］，但大量的胶质瘤细胞却不具备干细胞的生长特点。

1.2 多潜能分化 聚集成球的CD133（－）胶质瘤细胞在自然状态下无神经系三系标记物的表达，但进行分化诱导后发现其可获得表达GaIC、GFAP、MAP2的能力，证明它们较为原始，拥有分化为少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的趋势［2－3］，且可形成分化较为成熟的胶质瘤细胞。

1.3 自我更新 单个孤立的GSCs具有克隆能力并逐渐形成“球形聚集”。把聚集成球的CD133（－）胶质瘤细胞稀释成单个细胞进行培养时发现：16.9%～53.8%能够形成克隆并重新形成肿瘤球，与CD133（＋）GSCs比较无显著差异［3］。这些具有克隆能力的CD133（－）胶质瘤细胞在形成“肿瘤球”的过程中还可产生大量贴壁的胶质瘤细胞，而再次将贴壁细胞稀释成单个细胞后却失去了克隆能力。

1.4 致瘤性 致瘤性是CSCs的一大特点，在动物模型中发现一部分“聚集成球”、多潜能分化、自我更新的CD133（－）胶质瘤细胞也存在极强致瘤性， 只需要105～106该细胞就能在NOD／SCID鼠同位种植中成瘤［2－3］，其表型与原发肿瘤相似，出现胞核多形性、细胞过度分裂、组织坏死、微血管大量增生等，通过MRI检测显示其形态、大小和成瘤时间都与CD133（＋）GSCs所形成的肿瘤无显著差异［4－5］，但普通的胶质瘤细胞却不具备致瘤性［6］。

1.5 干细胞标记物 目前鉴定GSCs最常用的方法之一为使用干细胞标记物，而具备上述几种特征的CD133（－）胶质瘤细胞亦表达干细胞标记物Nestin［7］。

1.6 其他 在同一肿瘤组织中的不同区域往往存在组织或细胞学上的差别［8］，例如：细胞形态、血管密度、降解周围基底膜的能力、染色体核型分析、分子表型、信号通路、端粒和端粒酶的分析。同时CD133的表达也出现区域性差异，这一现象说明整个肿瘤组织可能起源于不同的遗传背景。Lottaz等［9］的研究证实极少部分CD133（－）胶质瘤细胞与NSCs存在相似的转录产物，尤其在抗凋亡中利用了相似通路，但大部分CD133（－）胶质瘤细胞却无类似的分子机制。

综上所述CD133（－）GSCs已逐渐被证实，它们在保持自我更新的同时能产生大量子代CD133（－）胶质瘤细胞，而这些子代胶质瘤细胞却失去了CSCs的特征。

2 CD133（＋）和CD133（－）GSCs的关系

目前的研究已证实CD133（－）GSCs的存在，但它们和CD133（＋）GSCs之间的相互关系一直是颇受争议的话题。有研究表明：①CD133（＋）GSCs的肿瘤和干细胞特征都明显强于CD133（－）GSCs，且CD133（＋）GSCs能够产生CD133（－）肿瘤细胞，所以CD133（＋）GSCs才是最为原始的胶质瘤起源因素；②CD133（＋）GSCs与CD133（－）GSCs相比端粒酶活性更强，在连续增殖过程中 CD133（－）GSCs的端粒缩短更为显著［10］。但值得关注的是由CD133（＋）GSCs产生的大部分CD133（－）肿瘤细胞却并不具备 CD133（－）GSCs的生物学性质［2］，因此这样的CD133（－）肿瘤细胞本质上与CD133（－）GSCs存在显著差异，同时也对“CD133（＋）肿瘤细胞才是胶质瘤唯一起源”这一学说产生质疑。

CD133（－）GSCs亦有可能是最为原始的肿瘤细胞：①CD133（＋）GSCs大多处于细胞周期S期、G2期和M期，但CD133（－）GSCs主要处于G0／G1期，即休眠状态，而这种静止状态更符合最原始干细胞慢周期的特点［11］；②在多个原代胶质瘤细胞中未发现CD133（＋）表达，但在干细胞培养条件下仍能产生“肿瘤球”，并在同位种植中再次出现与其原代肿瘤病理学特征相似的组织。Wang等［4］发现在这些起源于CD133（－）肿瘤细胞的新生肿瘤组织中出现了CD133的表达，说明一部分CD133（－）GSCs能够通过不对称分裂产生子代 CD133（＋）GSCs或自身转化成了CD133（＋）GSCs；③当肿瘤细胞出现缺氧或线粒体功能障碍时可促进CD133表达［12］，这也极其符合一部分CD133（－）肿瘤细胞能够在演变中产生CD133（＋）肿瘤细胞的观点，因此CD133可能只是在微环境的诱导下出现的一种分子表型，而并不具备纯化CSCs的能力。

上述两种观点虽然在“两种表型的GSCs谁产生谁”的争论中出现了矛盾，但却得到了“两类GSCs之间可以相互转化”的共识。但近年来还有证据支持CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs是两种独立、起源不同CSCs类型的观点：①虽然起源不同的胶质瘤其病理学形态相似，但是不同肿瘤之间的生长和预后差异性很大。有临床报道显示：源于CD133（－）GSCs的胶质瘤更容易发生在脑组织深部，且恶性程度更高［5］。②虽然它们都能形成“肿瘤球”，但其形态有差别。Beier等［2］发现CD133（＋）GSCs通常形成一个悬浮、孤立的“球形聚集”，CD133（－）GSCs却形成一个部分贴壁或完全贴壁的“肿瘤球”。③两者中与肿瘤性相关的 117个基因的表达也存在明显差异［2］。Lottaz［9］还发现CD133（＋）GSCs与胚胎NSCs转录产物相似，但CD133（－）GSCs却与成人 NSCs转录产物更为接近，而成年NSCs和胚胎NSC之间在转录物之间却具有很大差别，如在成人NSCs中CD44和EGFR明显高于胚胎NSCs，而CD133较胚胎NSCs明显下调。

目前的研究并不能明确CD133（＋） GSCs和CD133（－）GSCs之间的相互关系。更深层的探索发现［13］，可以把目前所认识的两类GSCs再次细分为三类：Ⅰ型为CD133（－）GSCs，它可以分裂成CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs；Ⅱ型为CD133（＋）GSCs，它也能产生CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs；Ⅲ型为CD133（－）GSCs，但它只能产生CD133（－）的子代肿瘤细胞，并且子代肿瘤细胞的增殖、侵袭、成瘤、耐药能力明显降低。这使得GSCs起源及不同表型GSCs之间相互关系更加复杂。

3 检测CD133（－）GSCs的局限性

CD133又名Prominin-1，是一种五次跨膜蛋白，分子量为120kD，因其在幼稚细胞中强阳性表达并随细胞分化成熟而表达降低以至消失，被认为是干细胞标志物。单克隆抗体的使用能够检测靶蛋白存在及含量，但目前的CD133抗体，如：AC133、AC141、293C等都是通过检测CD133表面一个特殊的糖基化表位来验证该蛋白的存在。根据抗体的检测特点，细胞分化过程中CD133的变化应理解为：随着干细胞分化，其糖基化表位逐渐减少而并非整个CD133蛋白［14］。以往通过免疫组织／细胞化学来研究CD133作为GSCs标志物时其精确定义为：CD133糖基化表位阳性的胶质瘤细胞为GSCs。因此探索CD133（－）GSCs除了要考虑该细胞原本就不存在CD133蛋白之外，在应用CD133抗体进行检测时还有许多 “由于CD133蛋白存在但无该糖基化表位”而出现的误导因素需要考虑：①在某些CD133蛋白表面无该表位或存在该表位但未糖基化，将检测不到CD133蛋白的存在。②肿瘤细胞较其它细胞更活跃，可能由于基因突变、微环境改变、信号通路异常等对CD133糖基化表位产生影响。③CD133蛋白的多种剪切变体可受甲基化调节，这使得每种变体不一定都存在其特异的糖基化表位而被CD133抗体识别［15］。④培养细胞使用的胰酶会对细胞膜蛋白氨基酸序列中多个不同位点进行切割，可能将影响CD133糖基化表位。⑤在对CD133（－）胶质瘤组织／细胞同时进行CD133 mRNA和蛋白检测时可发现CD133mRNA存在但无蛋白表达，说明该分子在转录后翻译水平可能丢失了该表位。用针对不同糖基化表位的CD133抗体对同一样本中CD133蛋白进行检测时也会出现差异［16］，这也暴露了抗体检测的不准确性。⑥此外CD133不仅在细胞膜上表达还可以在胞浆中少量表达［17］，当其定位于后者，有可能在流式细胞技术或免疫磁珠方法分选时被误认为是CD133（－）细胞。

直接用抗体来检测CD133表达存在局限性，其结果可能把CD133（＋）GSCs误认为CD133（－）GSCs，因此联合转录水平更有利于CD133（－）GSCs的研究。Beier［2］、Lottaz［9］认为：一部分CD133（－）胶质瘤细胞无论是在基因还是蛋白水平都未出现 CD133表达但确有 GSCs特征。Wang等［4］也从基因水平证实了一部分CD133（－）胶质瘤细胞在不断演进中能获得CD133的表达。这些结果弥补了使用抗体对CD133蛋白检测的局限性，而且证实了CD133（－）GSCs的真实存在。

4 CD133（－）GSCs标志物探索

CD133和Nestin以“两点一线”的方式成为了GSCs的标志物，但如今CD133（－）GSCs的出现却使得通过CD133来鉴定GSCs变得局限。因此需要一个更具权威的标志物联合Nestin对GSCs进行分选。

A2B5是位于细胞膜表面的神经节苷酯，在NSCs上可表达，其阳性的细胞具有分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能。通过分离得到的A2B5（＋）肿瘤细胞无论CD133表达如何都能形成“肿瘤球”，并且103数量级的该细胞就具有致瘤性，而A2B5（－）肿瘤细胞却不能［18］。但也有数据显示，A2B5（＋）肿瘤细胞在整个肿瘤成分中占有很大比例［19］，这与“CSCs只是肿瘤中一小部分群体”的概念相矛盾，可能GSCs只是包含于A2B5（＋）肿瘤细胞中的一部分群体。

SoX2（SRY-related homoebox transcription factor 2）是维持干细胞全能性的转录因子，且和CD133相似随着分化成熟其表达下调，已被作为NSCs的标志物。它也能够在胶质瘤中分选出的肿瘤球中表达［20］。Annovazzi等［21］发现，SoX2（＋）胶质瘤细胞具有抑制分化、无限增殖和致瘤性。但真正使用SoX2来进行GSCs分离并验证其可靠性的报道却很少，因此需要更多的研究进行指导。

侧群细胞 （side population cell，SP cell）是用DNA染料Hoechst33342对细胞进行染色后出现的染色偏低的群体。目前文献大多停留在CD133（＋）GSCs与SP细胞之间的相关性研究，这对研究CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs是否同时包含于SP细胞产生了局限。并非所有SP细胞都存在于“肿瘤球”中，而非SP细胞的自我更新能力和致瘤性可能更强且能转化为SP细胞［22］，说明在非SP细胞中可能也存在部分GSCs。

虽然目前还没有足够的证据表明上述几个标记物能够包含整个GSCs的不同亚型，但可以联合Nestin为寻找更加特殊的标记物和靶向治疗GSCs打下坚实基础。

5 展望

依据CD133（＋）GSCs作为标记物已产生了许多针对其靶点的治疗方法，虽然疗效有所改善但结局仍不尽如意。CD133（－）GSCs的提出不但解释了这一现象的本质，而且加深了人们对CSCs复杂多样性的认识。在胶质瘤中可能只存在两种GSCs，即CD133（＋）GSCs和CD133（－）GSCs；又或者在 CD133（－）GSCs中还存在多种不同亚型。根据全文所述，值得注意的是单凭针对CD133（＋）GSCs靶点的策略并不能实现对整个GSCs的杀灭，因此探索一个更为理想化的特异性标记物对GSCs进行筛选将成为对其全面认识的关键，并最终达到治愈胶质瘤的目标。

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2011－08－23）

（责任编辑：甘章平）

10.3969／j.issn.1002－0152.2012.01.016

* 重庆医科大学附属第二医院神经外科（重庆 400010）