RELN基因rs12705169位点与女性偏执型精神分裂症关联☆

郭伟云 张红星 赵晶媛 宋学勤 李文强 郝伟 吕路线

精神分裂症是一种慢性复杂性精神疾病，全球终身患病率达到1.0%[1]。脑结构和动物实验的结果均显示神经发育异常可能是精神分裂症的病因之一，精神分裂症的分子遗传学研究也证实了几个可重复的染色体定位和易感基因[2-3]，结果提示多个神经发育通路上的基因变异参与了精神分裂症的发展[4]。

RELN定位在人类染色体7q22.1，编码：388.42 Da的胞外基质丝氨酸蛋白酶。RELN影响神经元在大脑皮质和小脑的迁移，调控神经元和神经角质细胞的微管功能[5-6]。RELN在大脑、海马和小脑等脑结构片层结构形成中扮演关键角色[7]。脑形态和工作记忆能力与基因多态性的关联分析也报道了RELN与精神分裂症的认知功能损伤等有关[8-9]，Shifman等证实了 RELN的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP) 位点rs7341475在犹太人和英格兰人群中与女性精神分裂症患者相关联[10]。本课题组在前期研究中也发现在RELN基因的rs12705169位点与汉族女性精神分裂症患者关联[11]。本研究采用病例对照研究分析RELN基因多态性与中国汉族精神分裂症是否存在关联，采用另一样本群体对前期的研究结果进行重复和验证。

1 对象与方法

1.1 研究对象 为来自2009年至2011年在新乡医学院第二附属医院就诊的精神分裂症患者。入组标准：①符合美美国精神障碍诊断与统计手册第四版(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，Fourth Edition，DSM-Ⅳ)偏执型精神分裂症的诊断，由两名经过一致性培训的主治医师进行轴I障碍定式临床检查(Structured Clinical Interview for DSM-Ⅳ-TR Axis I Disorders-Patient Edition SCID-I／P)共同诊断；②年龄 17～46岁。 排除标准：患有重大躯体疾病(糖尿病、高血压、肿瘤等)、神经系统疾病和其它精神疾病者。共326例患者，男女各半，年龄 17～46岁，平均(26.54±5.24)岁。

正常对照组来自新乡医学院第二附属医院的职工、新乡市各医院的健康体检者及新乡医学院在校大学生。经精神科筛查本人无精神疾病史且父母二系三代中无精神障碍史及自杀史者，常规体检显示为健康状态，排除标准：童年或婴幼儿期出现过高热惊厥的；幼年被收养或生活于单亲家庭中，家族史不祥者；母孕期阶段有宫内窘迫等不良发育史或其出生阶段有产伤史者；有重大躯体疾病如糖尿病、高血压、肿瘤等。筛选出与患者组年龄和性别相匹配的334名正常对照，男女各半，年龄 18～42岁，平均为(26.37±6.30)岁。上述研究对象均为豫北地区的中国汉族无关个体。

本研究研究计划经新乡医学院第二附属医院伦理委员会审查通过，由研究对象或法定代理人签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA提取 所有受试者均采集外周静脉血，EDTA抗凝低温冻存待用。采用天根生化科技RelaxGene血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2 RELN 基因 rs12705169、rs11764507 和rs17157643位点基因分型 采用ABI7500型荧光定量PCR仪对每个SNPs位点进行基因型的测定，PCR条件为：95℃ 10 min，然后 92℃ 15 s、60℃ 60 s 循环40次，Taqman-MGB基因分型试剂购自美国ABI公司。对基因分型进行质量控制，随机抽取50例样本委托上海欧易生物医学科技有限公司采用ABI 3730基因测序仪对3个SNPs位点所在区域进行DNA直接测序，分析其基因型。

1.2.3 统计分析 关联分析、Hardy-weinberg平衡的分析采用HaploviewV4.1软件进行卡方检验。相对风险率以比值比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(confidence interval，CI)表示。 定量资料采用方差分析。其它统计学显著性水平设为双侧P值 ＜0.05。多重校正采用Bonferroni校正。基因型与性别相互作用采用SNPStats在线分析工 具 分 析[12]。 采 用 Genetic Power Calculator 计 算统计学效率。

2 结果

2.1 基因分型质量控制 荧光定量基因型检测结果与测序结果符合率99.25%。样本尺寸326能提供0.81的统计学效力发现对基因型分布的微效影响(r＝0.1～0.23)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡分析结果 3个SNPs中有两个SNPs基因型分布在全部样本中符合Hardy-Weinberg平衡(rs17157643：χ2＝0.759，P＝0.38；rs11764507：χ2＝0.013，P＝0.907)，rs12705169在患者组中不符合Hardy-Weinberg平衡，但在对照组中分布符合仍进入后续分析。

2.3 关联分析结果 患者组和对照组之间rs12705169的基因型(χ2＝24.61，P＜0.01)和等位基因频率(χ2＝21.26，P＜0.01)的差异具有统计学意义，患者组的A等位基因频率高于对照组(OR ＝1.73，95%CI＝1.39～2.11)。 两组rs11764507的基因型分布差异也有统计学意义(χ2＝ 7.96，P ＝ 0.019)。 但应用 Bonferroni校正后只有rs12705169仍然保持在基因型和等位基因分布上的阳性关联(均P＝0.001)。见表1。LD分析显示未发现3个SNPs构成的单体型与精神分裂症关联。

2.4 不同性别关联分析结果 按性别分层后在女性患者和对照中rs12705169的基因型分布差异具有统计学意义，rs12705169和rs17157643等位基因频率分布差异具有统计学意义；在男性患者和对照中3个SNP基因型分布差异不具有统计学意义。进行Bonferroni校正后只有rs12705169的基因型和等位基因频率(P＝0.001)在女性中与精神分裂症保持阳性关联(表1)。以女性最大等位基因纯合子在病例和对照之间的分布为参照，计算其比值比及95%可信区间，结果显示rs12705169的基因型和性别之间存在相互作用。基因型AA(OR＝0.43，95%CI＝0.18～0.45) 和AC(OR＝0.43，95%CI＝0.29～0.63)在女性患者中均表现为保护因素。global检验和一元线性Trend检验显示基因型与性别之间存在相互作用(均P＜0.01)。

3 讨论

最近的几项研究支持RELN与精神分裂症存在关联[9-15]。 Ekelund 等[13]在芬兰人群利用受累同胞对和家系确定染色体7q22区域与精神分裂症连锁，RELN位于这个区域。随后也是在芬兰人群中Wedenoja等[9]发现在RELN上的几个微卫星和SNPs与精神分裂症的语言功能、视觉记忆功能等存在关联，这一结果在他们进一步的工作中得到重复[14]。Shifman 等[10]报道的女性特异性关联位点rs7341475在徳裔犹太人中也得以重复[15]。本课题组前期研究中rs7341475与精神分裂症无关联[11]，这也与Shifman等[10]在汉族人群里的研究一致。本课题组前期研究中在汉族精神分裂症患者及其对照中对RELN基因37个SNP位点进行了研究，结果显示位点 rs12705169、rs11764507和 rs17157643与精神分裂症存在关联，本研究利用同一地区的另一群体对前期工作进行重复，考察的3个位点分析结果与前一阶段结果一致，佐证了前期结果的可靠性。

将本研究的对象按性别分层后单位点分析显示仅在女性中有2个关联位点，这一结果与Shifman 的报道类似[10]。

精神分裂症患者在临床因素上存在性别差异的报道并不少见，在症状、前驱行为和起病年龄等多方面均有表现。在遗传水平上存在性别差异也有不少报道。研究显示在大脑皮质第一层神经元RELN女性精神分裂症患者高于男性，在白质间隙只有男性患者的表达降低[16]。一般认为精神分裂症的性别差异与雌激素有关，RELN在脑发育过程中可能存在与雌激素的相互作用从而使其在精神分裂症患者中表现出女性特异性关联。虽然精神分裂症性别差异的确切的机制尚不明了，本研究为精神分裂症在遗传易感性上的性别差异提供了又一证据。

表1 两组rs12705169、rs17157643、rs11764507基因型和等位基因频率的比较

目前为止仍未见到有关rs12705169与精神分裂症关联的其它报道，这也与精神分裂症其它候选基因的研究情况类似，原因可能有以下几点。首先就是种族的不同；其次是与精神分裂症的异质性有关，此前的一些研究没有报道如诊断亚型之类的临床背景，精神分裂症基于不同症状表现在DSM-Ⅳ中被分为5个亚型，本研究限定在偏执型精神分裂症，一定程度上避免了表型异质性，潜在的提高了发现基因与疾病关联的效率；第三种可能性就是人群层化问题，以往的研究均没有切实的证据证实研究群体不存在人群层化，但他们的研究对象多从一个较广的地理区域收集而来，本研究对象均来自新乡市周边地区，人群层化分析这一客观手段也显示所有个体来自于一个遗传人群。

本研究为成功重复和验证了前期研究成果为RELN作为精神分裂症的易感基因提供了证据，这一阳性关联需要更大样本量和重复研究在不同群体里验证。

感谢 研究者向参与研究的病人和他的家庭以及健康志愿者表示衷心感谢，同时感谢为本研究收集样本做出贡献的新乡医学院第二附属医院的医护人员。

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