一株产蓝色素放线菌的筛选及发酵研究

全桂静， 邢继双

(沈阳化工大学环境与生物工程学院，辽宁沈阳110142)

食用色素是指能使食品着色或改善食品色调和色泽的食品添加剂［1］.它在食品中的含量非常少，但对食品质量及品质的影响非常大，是食品工业中不可缺少的添加剂之一.天然食用色素色泽自然、种类繁多、安全性高，食用天然色素已被广泛应用于饮料、糖果等食品的着色［2］.研究表明，一些食用天然色素对人体的多种疾病还具有非常突出的治疗、预防等药理作用和保健功能，也可用于医疗保健品、化妆品的着色，能更好地模仿天然物的颜色，着色时的色调比较自然［3］.利用微生物发酵法生产功能性食用天然色素，因其产率高、不受原料产地制约等优势，逐渐成为当前研究热点.目前我国准许使用的色素中，蓝色素主要是从桅子、螺旋藻、念珠藻、紫甘蓝等原料中提取，并对其性质、稳定性进行了研究，但发酵生产蓝色素却不多见［4］.因此，开发和选育出能大量生产天然蓝色素的微生物具有一定意义.本文从土壤中筛选出1株蓝色素高产菌株产量稳定，以期可以丰富食用蓝色素的物种.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

沈阳化工大学院内土壤.

1.1.2 培养基配方

(1)初筛培养基(g/L)［4－5］

可溶性淀粉 20，KNO31.5，K2HPO40.5，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，K2Cr2O70.1，琼脂20，pH=7.5，121℃高压蒸汽灭菌30 min.

(2)发酵培养基(g/L)

可溶性淀粉 20，KNO31，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，NaCl 0.5，pH=7.5，121℃高压蒸汽灭菌30 min.

1.2 实验方法

1.2.1 蓝色素产生菌株的筛选

(1)初筛:采用10倍稀释法对土样进行充分稀释.将初筛培养基倒入无菌培养皿，凝固制成平板.取1 mL稀释液涂布于平板上，30℃恒温培养96 h.

(2)复筛［5］:初筛的菌株转接斜面后，在恒温培养箱内30℃培养5 d，制成108/mL单孢子悬液.取1 mL悬液接种于装有100 mL发酵培养液的250 mL的三角瓶中，30℃、160 r/min条件下培养96 h，测定色素产量.

1.2.2 蓝色素产量的测定方法［5－6］

发酵液采用sigma 2-16P台式高速离心机5 000 r/min离心30 min，取上清液.以空白培养基为对照，利用722型分光光度计在590 nm波长处测A值［5］，以表示发酵液中色素的产量.

1.2.3 蓝色素生产条件的研究［5－7］

(1)营养条件的研究:利用常用的糖类及无机、有机含氮化合物分别作为碳源和氮源，250 mL三角瓶中装100 mL液体培养基，按2%比例接种，在30℃，160 r/min的条件下恒温振荡培养96 h，确定适宜的营养条件.

(2)发酵条件的优化:在确定营养条件的基础上，考察温度、发酵时间等因素对色素生产的影响，以优化发酵条件.

(3)正交试验的设计:根据单因素的试验结果，设计4因素3水平的正交试验，结果见表1.

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

(4)正交试验的验证试验:按以上正交试验结果的最优配比，进行发酵重复试验.

1.2.4 蓝色素的提取与色价测定

(1)色素的提取:向90 mL色素粗溶液中滴加2 mol/L的NaOH溶液10 mL，在50℃恒温水浴锅中作用30 min使色素充分沉淀，采用sigma 2-16P台式高速离心机7 800 r/min离心30 min后，干燥即得色素粗提物.

(2)粗提物色价的测定:按1∶100的比例用pH9.0Tris-HCl缓冲溶液溶解色素粗提物，使色素充分溶解［8－9］，用722型可见分光光度计在波长590 nm处测吸光度.按公式

计算色价［10］.式中，A为实测试样的吸光度;α为稀释倍数.

2 结果与讨论

2.1 蓝色素生产菌株的筛选

2.1.1 初筛

土样经稀释并在初筛培养基平板上培养后，共筛得7株产水溶性蓝色素的放线菌，见图1.

图1 蓝色素产生菌株的菌苔Fig.1 The lawn of blue pigment producing strain

2.1.2 复筛

对初筛得到的7株菌进行液体发酵，发酵液离心后测A590，结果见表2.由表2可知5号菌株发酵液的A590值较高，命名为Cya-5.

表2 初筛菌株的蓝色素产量Table 2 The blue pigment production of the screening strains

2.2 蓝色素生产条件的研究结果

2.2.1 碳源对蓝色素生产的影响

以20 g/L的蔗糖、甘油、葡萄糖、柠檬酸三钠、可溶性淀粉等作为碳源，1 g/L的KNO3为氮源，研究蓝色素的发酵情况，结果见图2.

图2 碳源对蓝色素生产的影响Fig.2 The effect of carbon source on the pigment fermentation

由图2结果可知，碳源对蓝色素发酵生产的影响较大，其中以甘油为碳源时，A590最大为5.01，可溶性淀粉次之.因此确定甘油为蓝色素发酵用碳源.

2.2.2 氮源对蓝色素生产的影响

确定碳源为甘油后，以1 g/L蛋白胨，硫酸铵，硝酸钾作为氮源，以及不加氮源，研究蓝色素产量，结果如图3所示.由图3可知，以KNO3为氮源时，A590最大为5.32，可见KNO3有利于蓝色素的生产.

图3 氮源对蓝色素生产的影响Fig.3 The effect of nitrogen source on the pigment fermentation

2.2.3 发酵液初始pH值对蓝色素生产的影响

配制培养基时，调节不同的pH值，研究初始pH对发酵的影响，结果见图4.结果显示，pH对蓝色素生产的影响较大，当pH在8.0左右时，A590最大为5.98.这与放线菌的最适生长pH范围7.5～8.5基本一致.

图4 初始pH对蓝色素生产的影响Fig.4 The effect of initial pH on the pigment fermentation

2.2.4 发酵温度对蓝色素生产的影响

在最适碳源、氮源、pH值的条件下，考察发酵温度对蓝色素产量的影响，结果如图5所示.由图5可以看出:当发酵温度为30～35℃时，色素产量和胞外分泌率都是比较好的，但尤以30℃为最佳.当温度大于40℃时，该放线菌基本不产蓝色素.

图5 发酵温度对蓝色素生产的影响Fig.5 The effect of temperature on the pigment fermentation

2.2.5 发酵时间对蓝色素生产的影响

在以甘油为碳源，硝酸钾为氮源，pH=8.0，30℃发酵，测量不同发酵时间蓝色素的产量，结果如图6所示.由图6结果可知，发酵96 h时，A590达到最大值为5.96，因此96 h为蓝色素的最佳收获时间.

图6 发酵时间对蓝色素生产的影响Fig.6 The effect of fermentation time on the pigment fermentation

2.2.6 正交试验

按4因素3水平的正交实验表进行发酵实验，发酵液预处理后，经过10倍稀释后测定A590，结果及分析见表3.结果显示最佳组合为A2B2C3D2，即最优培养基配方为:甘油20 g/L，KNO31 g/L，pH值为8.5，装液量为100 mL/250 mL三角瓶，总A值可达12.02.数据分析显示，在研究的4个因素中，对发酵影响最大的因素是氮源浓度，其次为碳源浓度.

表3 正交实验结果表Table 3 Results of orthogonal experiment

按上述正交实验最优配比，进行验证实验，发酵液经预处理后，稀释10倍后测定A590，发酵中蓝色素产量基本稳定，总A590在12.24左右.

2.3 蓝色素粗提物的性状及色价

用2 mol/L NaOH提取，蓝色素粗提物的平均得率为64.1 g/100 L.粗提物为不均匀的黑蓝色片状颗粒.关于微生物蓝色素的报道中多为粗溶液的研究，仅有报道的蓝色素粗提物为紫红色素粉末［11］，本实验提取得到的色素为新物质.

在碱性条件下加热搅拌，促进粗色素溶液中的蛋白质等物质与色素分子结合，并发生沉淀，形成粗提物.将色素粗提物用pH=9.0的缓冲溶液溶解，出现少量的不溶物，溶液在590 nm处测定A值，根据公式计算色价为45.8.

3 结论

利用初筛培养基从土壤中筛选得到7株能产生蓝色素的放线菌，其菌落及周围培养基中扩散有大量水溶性的蓝色素.利用液体发酵法对初筛得到的菌株进行复筛，其中有2株放线菌无色素产生，另有1株放线菌的产量突出，命名为cya-5.

对cya-5的发酵条件进行研究，结果显示蓝色素生产的最优培养基配方为甘油20 g/L、KNO31 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，NaCl 0.5 g/L，初始pH值为8.5，其中氮源浓度和碳源浓度对色素产量影响较大;培养温度为30℃，装液量为100 mL/250 mL，发酵时间为96 h，发酵液的A590值可达12.02，与张和春等研究的分泌色素量相比较，略高.

碱沉发酵液得到不均匀的黑蓝色片状色素物质，该物质比较稳定，溶解于pH=9的水溶液呈现深蓝色.通过测定，该色素粗提物的色价为45.8，较市售的栀子蓝色素的色价低，主要原因为粗提物的纯度不够，在以后的研究工作中应进一步纯化.

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