中国炭疽芽胞杆菌中11个串联重复序列位点的特征和分布＊

魏建春，张恩民，张慧娟，张建华

炭疽芽胞杆菌是引起人和动物炭疽的病原菌，是一种相对保守的细菌，很多基因分型方法都不能对其分型，已经知道多位点串联重复序列分析方法（MLVA）［1］和单核苷酸多态性分析（SNP）［2］是两种比较有效的区别不同炭疽芽胞杆菌的方法。我们对本实验室保存的炭疽芽胞杆菌菌株进行了MLVA的分析，发现有一些串联重复序列（VNTR）位点在我国的菌株中很保守，在被试菌株中没有区别或只有个别菌株出现变化，特对这些相对保守位点，进行进一步分析，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1．1 实验菌株 本实验室保存的109株炭疽芽胞杆菌，来自全国17个省份。

1．2 引物设计11个VNTR位点 MS15、MS21、MS22、MS23、MS25、MS28、MS44、vrrA、vrrB1、vrrB2、MS53扩 增 用 引 物 序 列 参 照 文 献 报 道［1，3－4］，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1．3 材料 2×easy Taq Super Mix、DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司，测序和毛细管电泳由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

1．4 PCR扩增和检测 反应体系：12．5μL 2×mix，1μL模板，上下游引物各0．2μmol／L，加水至25μL。VNTR位点 MS15、MS21、MS22、MS23、MS25、MS28、MS44使用以下扩增条件：95℃预变性5min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环，最后72℃延伸5min。上样5μL，2%琼脂糖凝胶5V／cm电泳2～3h。VNTR位点vrrA、vrrB1、vrrB2和MS53使用以下扩增条件：95℃预变性5min，95℃30s，60℃30s，72℃1min，34个循环，最后72℃延伸5min。扩增产物送公司进行毛细管电泳。

1．5 测序验证 选择部分扩增产物送测序。

1．6 序列比对BLAST和Megaline软件进行序列比对。

2 结 果

2．1 保守位点的PCR扩增结果以及差异菌株在我国的分布 本实验中11个位点比较保守，有4个位点 MS53，vrrB1，MS21，MS44，所试菌株扩增结果全部相同，扩增产物与已测序菌株Ames完全一致。另外7个位点中的5个，大多数的被试菌株表现出与Ames一致的特征，只有2个位点vrrB2和MS15，大多数被试菌株表现的特征与Ames不同，2个位点各检测出1株与Ames相同的菌株。综合11个VNTR位点，我国的菌株没有检测到与Ames完全相同的菌株。

在所试的109株菌中，仅10株菌与大多数菌株有差别，为分离自新疆的2株菌与分离自内蒙古的1株菌在2个位点上与大多数菌株不同，其他7株菌仅有1个位点与多数菌株不同。有差别的菌株多出现在新疆，新疆的4株菌6次检测出与其他菌株不同，提示新疆的菌株类型比较复杂，见表1。

表1 11个VNTR位点的PCR扩增结果及差异菌株在我国的分布Tab．1 PCR results of 11VNTR loci and distribution of divergentstrains

2．2 扩增PCR产物所在基因特征 BLAST检索发现这11个VNTR位点所在基因可分为3类，一类是MS28，MS44，MS25，MS23在炭疽芽胞杆菌中有基本明确的功能注释，一类是 MS21，MS15，MS22在炭疽芽胞杆菌中没有明确的注释，但在与其近源的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌中有与其同源性很高的基因，有相应的注释可供参考；另一类是VrrA，VrrB1或 VrrB2，MS53在炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌中均为假想蛋白，没有明确的功能注释。详细情况见表2。

表2 11个VNTR位点所在基因编码产物Tab．2 The encoded proteins of these genes including 11VNTR loci

3 讨 论

MLVA是目前对炭疽芽胞杆菌菌株鉴别和分型比较有效的方法之一。经常使用的有二十多个位点。本研究主要针对我国菌株中比较保守的位点进行分析。

新疆的菌株类型复杂前有报道［5］，本文发现的有差别的菌株多出现在新疆，虽然与本次试验所用新疆菌株数量多有一定关系，但一样显示新疆的炭疽菌株确实复杂多样。这可能与新疆地域广大，病例较多，细菌有更多的机会发生变化有关。

BLAST比对发现本实验所选的11个位点都在基因编码区内，都以3的倍数重复，不会改变蛋白编码序列，只是增加或减少相应的氨基酸个数。

4个位点所在基因的编码产物在炭疽芽胞杆菌中有明确的注释，包括青霉素结合蛋白（PBP）、细胞壁内肽酶NlpC／P60家族、芽胞壳组装蛋白SafA、Internalins。PBP参与细菌细胞壁主要成分——肽聚糖合成的最后阶段，在细菌生长、繁殖中发挥重要作用［6］。芽胞壳组装蛋白SafA在芽胞壳的组装过程中具有重要作用［7］。细胞壁内肽酶NlpC／P60家族，在细菌的生长发育繁殖过程中，通过水解肽聚糖的各种连接而使细胞壁重组［8］。Internalins是最初在单核细胞增多性李斯特菌中发现的表面蛋白，在细菌通过钙粘素跨膜蛋白侵袭宿主细胞时使用，这些蛋白的确切作用以及侵袭力尚不完全清楚［9］。该蛋白与一个与铁转运有关的蛋白一致性较高487／572（85%），提示可能对于细菌的生长繁殖具有重要作用。

3个位点所在的基因序列与其近源的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌相似，提示可能具有与蜡样和苏云金中相似的功能。其中值得一提的是MS15，MS15所在基因在炭疽芽胞杆菌中编码BclD蛋白（Bacilluscollagen like protein），与芽胞外壁蛋白BclA相似。BclA蛋白是芽胞外壁发状菌丝的主要结构成分，是主要的芽胞表面蛋白，影响芽胞的疏水性和粘附性。后来发现的BclB也鉴定是炭疽芽胞杆菌芽胞外壁的成分，之后又发现BclC、BclD、BclE、BclF和BclG等相似结构蛋白，可能具有与BclA和BclB相似的功能［10］。

还有4个位点所在基因没有注释明确的功能，似乎只是人们在炭疽芽胞杆菌中发现的具有高度可变性的群特异性的蛋白。已有文献［11］提到VrrA是AVA疫苗在人体诱导的免疫反应的一个靶蛋白，提示它可能是炭疽芽胞杆菌的潜在毒力因子。这些没有明确注释的蛋白可能也具有一定的功能，因此在细菌生长繁殖过程中不易发生突变，即使突变也不改变蛋白的主要结构和功能。

本实验中所选择的VNTR位点都在基因编码区内，所在基因的编码产物可能在细菌的生长繁殖过程中具有比较重要的作用，因此不易发生突变。本文结果提示这些VNTR的变异度较小，可能不适用于我国炭疽芽胞杆菌的分子分型，但对于我们了解炭疽芽胞杆菌基因组特征以及炭疽芽胞杆菌的鉴定仍有一定的价值。

［1］Keim P，Price LB，Klevytska AM，et al．Multiple－locus variable－number tandem repeat analysis reveals genetic relationships withinBacillusanthracis［J］．J Bacteriol，2000，182：2928－2936．DOI：10．1128／JB．182．10．2928－2936．2000

［2］Read TD，Salzberg SL，Pop M，et al．Comparative genome sequencing for discovery of novel polymorphisms inBacillusanthracis［J］．Science，2002，296：2028－2033．DOI：10．1126／science．1071837

［3］Le Flèche P，Hauck Y，Onteniente L，et al．A tandem repeats database for bacterial genomes：application to the genotyping ofYersiniapestisandBacillusanthracis［J］．BMC Microbiol，2001，1：2．DOI：10．1186／1471－2180－1－2

［4］Lista F，Faggioni G，Valjevac S，et al．Genotyping ofBacillus anthracisstrains based on automated capillary 25－loci multiple locus variable－number tandem repeats analysis［J］．BMC Microbiol，2006，6：33．DOI：10．1186／1471－2180－6－33

［5］Wang BX，Smith KL，Keys C，et al．Molecular epidemiology ofBacillusanthracisin China［J］．Prog Microbiol Immunol，2002，30（1）：14－17．（in Chinese）王秉翔，Smith KL，Keys C，等．中国的炭疽杆菌DNA分型及其地理分布［J］．微生物学免疫学进展，2002，30（1）：14－17．

［6］Macheboeuf P，Contreras－Martel C，Job V，et al．Penicillin binding proteins：key players in bacterial cell cycle and drug resistance processes［J］．FEMS Microbiol Rev，2006，30（5）：673－691．DOI：10．1111／j．1574－6976．2006．00024．x

［7］Lai EM，Phadke ND，Kachman MT，et al．Proteomic analysis of the spore coats ofBacillussubtilisandBacillusanthracis［J］．J Bacteriol，2003，185（4）：1443－1454．DOI：10．1128／JB．185．4．1443－1454．2003

［8］Anantharaman V，Aravind L．Evolutionary history，structural features and biochemical diversity of the NlpC／P60superfamily of enzymes［J］．Gen Biol，2003，4：R11．DOI：10．1186／gb－2003－4－2－r11

［9］Schubert WD，Urbanke C，Ziehm T，et al．Structure of internalin，a major invasion protein ofListeriamonocytogenes，in complex with its human receptor E－cadherin［J］．Cell，2002，111（6）：825－836．DOI：10．1016／S0092－8674（02）01136－4

［10］Leski TA，Caswell CC，Pawlowski M，et al．Identification and classification ofbclgenes and proteins ofBacilluscereusgroup organisms and their application inBacillusanthracisdetection and fingerprinting［J］．Appl Environ Microbiol，2009，75（22）：7163－7172．DOI：10．1128／AEM．01069－09

［11］Kudva IT，Griffin RW，Garren JM，et al．Identification of a protein subset of the anthrax spore immunome in humans immunized with the anthrax vaccine adsorbed preparation［J］．Infect Immun，2005，73（9）：5685－5696．DOI：10．1128／IAI．73．9．5685－5696．2005