5种抗原检测囊型包虫病血清学评价＊

高春花，汪俊云，杨玥涛，石 锋，朱慧慧，焦 伟

人囊型棘球蚴病又称囊型包虫病，是由细粒棘球绦虫的幼虫寄生所致，是一个重要的世界性公共卫生问题。我国西部是世界上包虫病患病率最高的地区，包虫病是当前我国危害最严重的寄生虫病。目前，对包虫病的诊断主要依赖影像学方法，但该法不能进行早期诊断，造成患者错过最佳药物治疗期，因此，需要寻求简便高效的免疫学方法，抗原的选择是影响免疫学方法检测效能的关键。迄今，已对多种抗原进行了评价，但结果差异很大［1－3］。本文对多种抗原，包括羊细粒棘球蚴纯化包囊液粗抗原（Hydatid cyst fluid，HCF）、天然抗原B （Antigen B，AgB）及从我国新疆源细粒棘球蚴原头节克隆表达的 AgB亚基（AgB8／1、AgB8／2和 AgB8／3）检测囊型包虫病的性能进行比较，以期筛选出较为理想的抗原应用于免疫学方法检测我国的囊型包虫病。

1 材料与方法

1．1 血样 手术确诊细粒棘球蚴病人血清87份，分别由新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心（44份）、甘肃省疾病预防控制中心（43份）提供。20份手术确诊多房棘球蚴病人血清由宁夏区疾病预防控制中心惠赠。囊尾蚴病病人血清25份、血吸虫病病人血清12份、弓形虫病人血清10份、卫氏并殖吸虫病人血清8份和华支睾吸虫病病人血清9份为本所血清库提供，上海市健康人血清60份。

1．2 试剂与试剂盒 TRIzol（Invitrogen），反转录试剂盒（Promega），琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（北京索莱宝公司），内切酶EcoRI，BamHI（Fermentas）pGEX－3X载体（Amersham），DH5α感受态细胞和BL21（DE3）感受态细胞（TIANGEN），质粒抽提试剂盒（OMEGA），谷胱甘肽琼脂糖4B树脂（GE healthcare），蛋白酶Factor Xa（Amersham），羊抗人IgG辣根过氧化物酶结合物（Invitrogen），3，3′，5，5′－四甲基联苯胺（TMB）（TIANGEN）。

1．3 纯化HCF和天然AgB的制备按参考文献［1］进行。

1．4 AgB三个亚基克隆表达和重组抗原的纯化取－70℃冻存的新疆源细粒棘球蚴原头节，按说明书用TRIzol法提取总RNA，采用RT－PCR方法扩增目的基因片段。引物序列与扩增条件见参考文献［4］。PCR产物与pGEX－3X载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将含有正确插入片段的重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，挑取单一菌落于LB培养基中培养，1mmol／L IPTG，28℃ 诱导表达4h［5］。

用谷胱甘肽琼脂糖4B树脂亲和纯化重组蛋白后用蛋白酶Factor Xa将融合蛋白的GST切下，测目的蛋白浓度后－30℃保存备用。

1．5 ELISA 参照文献［6］并做适当调整。简言之，纯化HCF包被量为1μg／孔，nAgB包被量为0．25 μg／孔，重组抗原的包被量为0．3μg／孔。血清样本的稀释度为1∶200。羊抗人IgG辣根过氧化物酶结合物的工作浓度为1∶30 000，加入TMB底物显色后在450nm波长处测定吸光度（A）值。以60个非疫区健康人血清的A450均值加3个标准差（x＋s）定为阳性阈值，每份血清做两个孔，受检样本的A450平均值等于或大于阈值者判为阳性。

1．6 统计学分析 敏感度、特异度和诊断效能的计算方法按文献［7］进行。采用Excel 2000进行统计分析，各种抗原检测结果用χ2检验进行分析。

2 结 果

2．1 AgB三个亚单位基因的克隆表达 以我国新疆源细粒棘球绦虫分离株原头节材料用RT－PCR方法成功获得AgB8／1，AgB8／2和AgB8／3的基因片段，片段长度分别为213、258和243个碱基，推测分别编码的氨基酸个数为71个、86个和81个。推导的氨基酸序列如下：AgB8／1（VVVTQADDGLTSTSRSVMKMFGEVKYFFERDPLGQKVVDL LKELEEVFQLLRKKLRMALRSHLRGLIAEGE）；AgB8／2（TYILLSLALVAFVAVVQAKDEPKAH MGQVVKKRWGELRDFFRNDPLGQRLVALGN DLTAICQKLQLKIREVLKKYVKNLVEEKDDD）和AgB8／3（ALA LVSFVVVAHADDDDDEVTKT KKGVMKAISEIKHFFQSDPLGKKLVEVMKDV ASVCEMVRKKARMALKEYVRKLVKEDE）。用蛋白酶Factor Xa将AgB8／1，AgB8／2和AgB8／3融合蛋白的GST切下，见图1。

2．2 ELISA 以制备的纯化 HCF、nAgB 、rAgB8／1、rAgB8／2和rAgB8／3为包被抗原，检测87份囊型包虫病患者血清、20份泡型包虫病患者血清、64份其它，结果见表1、2。

图1 pGEX－3X－AgB三个亚基融合蛋白表达及纯化的16%SDS－PAGE鉴定M：标准蛋白分子量；1：未诱导的PGEX－3X空质粒；2：经IPTG诱导的PGEX－3X空质粒；3，7，11：未诱导的PGEX－3X－AgB8／1，2，3；4，8，12：经IPTG诱导的PGEX－3X－AgB8／1，2，3；5，9，13：PGEX－3X－AgB8／1，2，3融合蛋白经谷胱甘肽琼脂糖4B树脂纯化后；6，10，14：PGEX－3X－AgB8／1，2，3 融 合 蛋 白 经 蛋 白 酶Factor Xa消化后Fig．1 SDS－PAGE （16%）analysis of three pGEX－3X－AgB subunits expressed in E．coli BL21cellsM：Molecular marker；1：pGEX－3Xempty vector before induction；2：pGEX－3Xempty vector after induction；3，7，11：pGEX－3X－AgB8／1，2，3whole cell without IPTG induction；4，8，12：soluble fractions of pGEX－3X－AgB8／1，2，3with IPTG induction after cellular disruption；5，9，13：purified pGEX－3X－AgB8／1，2，3fusion protein；6，10，14：pGEX－3X－AgB8／1， 2， 3after digestion by Factor Xa．

3 讨 论

本文应用纯化 HCF、nAgB、rAgB8／1、rAgB8／2和rAgB8／3抗原作为包被抗原，用ELISA法检测了87份囊型包虫病患者和84份非囊型包虫病患者和60份健康人血清中特异抗体，结果表明天然抗原（纯化的HCF和nAgB）检测的敏感度高于重组抗原（rAgB8／1、rAgB8／2和rAgB8／3）（P＜0．05）；而3个重组抗原中rAgB8／2检测的敏感度高于rAgB8／1、和rAgB8／3（P＜0．05）；纯化 HCF 与nAgB、rAgB8／1、rAgB8／2和rAgB8／3诊断的特异度之间均无统计学差异（P＞0．05）。总体诊断性能也是两种天然抗原优于重组抗原，这与其他作者的研究结果一致［6］。

迄今免疫学方法检测囊型包虫病仍以天然的细粒棘球蚴包囊液粗抗原敏感度最高，但由于囊液中成分复杂，既有虫体本身的代谢分子，又有宿主的代谢物（主要是白蛋白和免疫球蛋白），且来源相异，不易标准化［8］。AgB是细粒棘球蚴包囊液中含量最丰富的组分之一，是目前免疫检测囊型包虫病最有前景的组分抗原。AgB是由数个约8kDa的亚基组成的多聚体，目前，已知至少有5个亚基组成了AgB，即EgAgB1，EgAgB2，EgAgB3，EgAgB4，和 EgAgB5［3，9］，EgAgB1和 EgAgB2重组蛋白应用于囊型包虫病的诊断已有广泛研究，EgAgB2显示了很好的诊断效能［10］，这与本课题组前期的研究结果一致［5］。

表1 5种抗原检测囊型包虫病患者血清和对照血清阳性率［%（阳性数／检查数）］Tab．1 Results of sera examined by ELISA with five antigens

表2 5种抗原ELISA检测囊型包虫病患者血清的诊断性能Tab．2 Diagnostic performance of the five Echinococcus granulosus antigens

结果表明，无论是天然抗原还是重组抗原均与泡型包虫病人血清存在不同程度的交叉反应（45%～90%），与其他作者的研究结果一致［11］。事实上，细粒棘球绦虫AgB各个亚基的同源物均存在于多房棘球绦虫中，各亚基的同源物无论在基因序列还是其编码的氨基酸序列水平上均显示非常高的同源性（达90%左右）［9］，这就解释了血清学检测中两者存在较多交叉反应的原因。本次研究中的所有抗原与囊尾蚴病人、血吸虫病人、肝吸虫病人、肺吸虫病人和弓形虫病人血清也存在不同程度的交叉反应。其中，天然抗原（纯化HCF和nAgB）与囊尾蚴病人血清的交叉反应较多，因为二个虫种之间具有共同的抗原表位［2］。

5种抗原中纯化的天然抗原和rAgB8／2对人囊型包虫病诊断效能较高，但它们检测的敏感度和特异度仍有很大局限，不能满足诊断需要，因此，迫切需要筛选出诊断效能更高的新抗原以满足诊断囊型包虫病之需。

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