α干扰素和利巴韦林抗丙型肝炎病毒作用的比较研究

杨猛，何胜菲，任浩，赵兰娟，戚中田

1. 第二军医大学研究生管理大队临床十队，上海 200433； 2. 第二军医大学微生物学教研室，上海市医学生物防护重点实验室，上海 200433

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染可导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌及一些自身免疫性疾病，感染人数约1.7亿[1]。然而，治疗HCV感染可供选择的药物极其有限。α干扰素(interferon α, IFN-α)联合利巴韦林是临床治疗丙型肝炎的标准方案。IFN-α作为抗病毒感染的第1道防线，在病毒感染人体后迅速发挥抑制病毒复制和增强免疫反应的作用[2]。研究表明，IFN诱导的细胞内信号转导与其抗病毒效应有关。IFN与细胞表面特定受体结合后启动相应信号转导途径，激活Janus激酶/信号转导和转录激活子的经典途径，从而调节一系列干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene,ISG)的表达，发挥抗病毒效应[3,4]。利巴韦林是于1970年发现的具有广谱抗病毒活性的鸟嘌呤类似物，通过抑制鸟嘌呤合成，使病毒缺乏合成RNA所需的鸟嘌呤而无法复制。

由于高效体外细胞培养系统和合适小动物模型的长期缺乏，阻碍了对HCV致病机制的深入了解及抗病毒药物和疫苗的研制。近年来，感染性细胞培养产生的HCV(cell culture-derived HCV, HCVcc)的建立极大地推动了HCV致病机制研究、药物筛选和疫苗研制工作[5-7]。本研究采用体外培养的感染性病毒HCVcc为研究对象，比较IFN-α和利巴韦林对HCV复制的影响，以及对干扰素调节因子9(interferon regulatory factor 9, IRF9)和ISG15等抗病毒基因的调节能力。

1 材料和方法

1.1 主要材料

重组人IFN α-2a 和利巴韦林分别为PBL和Merck产品。DMEM 和胎牛血清为HyClone产品。HCV NS3鼠单克隆抗体(简称单抗)和β-actin抗体分别购自Abcam和Cell Signaling Technology公司。HCV E2鼠单抗由Chiron公司Dr. Houghton提供。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)-羊抗兔或抗鼠抗体和TRIzol试剂购自Invitrogen公司。增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂为Millipore产品。莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，M-MLV)反转录酶为Promega公司产品。SYBR Green PCR Kit 购自百泰克公司。Huh7.5.1细胞和HCVcc(J6/JFH1，基因型2a)由本实验室提供，其中HCV 2a J6/JFH株全长基因组质粒FL-J6/JFH1由美国洛克菲勒大学HCV研究中心Dr. Rice教授惠赠。HCVcc的制备及效价测定参见文献[8]。

1.2 方法

1.2.1细胞培养Huh7.5.1细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。细胞培养液中添加2 mmol/LL-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、100 μg/ml链霉素和100 u/ml青霉素。

1.2.2IFN和利巴韦林处理细胞Huh7.5.1细胞种植于24孔板内培养过夜，吸弃培养液，用磷酸缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗1次；将1×105FFU/ml HCVcc以30 μl/孔于37 ℃培养2 h，吸弃病毒液，用PBS洗1次。将含不同浓度IFN-α(0、100、200、400、800、1 000 u/ml用于检测HCV RNA，5、10、20、40、80、100 u/ml用于检测抗病毒基因水平)和利巴韦林(0、1、20、100 μg/ml用于检测HCV RNA水平和蛋白表达，1、5 μg/ml用于检测抗病毒基因水平)的10%胎牛血清DMEM培养基加入孔内，继续培养72 h或96 h。细胞经PBS洗涤后分别制备RNA和蛋白样品，用于实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction， PCR)和蛋白免疫印迹检测。

1.2.3引物合成HCV 5′非编码区上游引物：5′-CTTCACGCAGAAAGCGTCTA-3′；下游引物：5′-CAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′。内参GAPDH上游引物：5′-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3′；下游引物：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3′。IRF9上游引物：5′-CCACCGAAGTTCCAGGTA-ACAC-3′；下游引物：5′-AGTCTGCTCCAGCAA-GTATCGG-3′。ISG15上游引物：5′-CTCTGA-GCATCCTGGTGAGGAA-3′；下游引物：5′-AA-GGTCAGCCAGAACAGGTCGT-3′。上述引物委托上海英骏生物技术公司合成。

1.2.4实时PCR用TRIzol试剂提取细胞总RNA。反转录反应体系及条件：1 μg RNA，DEPC水补至10 μl，与100 μmol/L随机引物 1 μl混匀，于70 ℃水浴5 min，立即冰浴2 min；然后加入5×M-MLV Buffer 5 μl、10 mmol/L dNTP 1.5 μl、M-MLV 1 μl，DEPC水补至25 μl，混匀于37 ℃水浴1 h以合成cDNA。以上述cDNA作为模板，分别扩增HCV、IRF9、ISG15和GAPDH。反应体系和条件：cDNA模板 2 μl、2×SYBR Green I 10 μl、上游引物(10 μmol/L)0.4 μl、下游引物(10 μmol/L)0.4 μl、双蒸水7.2 μl，混匀后用Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪进行扩增。扩增条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 25 s，共40个循环。选定未处理组细胞样品作为对照，经内参GAPDH均一化处理，用DeltaDelta CT Relative Quantitation进行相对定量分析。所用软件为Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1。

1.2.5蛋白免疫印迹法蛋白样品制备参见文献[9]。样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离，转移至硝酸纤维素膜，5% 脱脂奶粉封闭1 h；膜与HCV NS3鼠单抗(1∶1 000)、HCV E2鼠单抗(1∶500)或β-actin抗体(1∶1 000)于4 ℃过夜，与1∶1 000稀释的HRP-羊抗兔或抗鼠抗体于室温孵育1 h。ECL试剂显影，并用GeneGnome HR image capture获取图像。所用软件为GeneTools from SynGene。

1.3 统计学分析

采用t检验进行分析，P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 不同剂量IFN-α对HCV RNA水平的影响

首先评估IFN-α对HCVcc在Huh7.5.1细胞内复制的影响。将HCVcc感染的Huh7.5.1细胞用含不同浓度IFN-α(0、100、200、400、800、1 000 u/ml)的培养液培养72 h，并抽提细胞RNA；然后采用实时PCR检测HCV RNA。图1表明，100 u/ml IFN-α可显著降低HCV RNA水平(P<0.05)。

Huh7.5.1 cells infected with HCVcc were cultured in the media containing IFN-α at the indicated doses. Real-time PCR was performed on the extracted RNA. HCV RNA levels are shown as relative percentages of the IFN-α-untreated control. The data are expressed as the mean value and the standard deviation of triplicate experiments.

2.2 利巴韦林和IFN-α对HCV RNA水平及蛋白表达的影响

将HCVcc感染的Huh7.5.1细胞用含不同浓度利巴韦林(0、1、20、100 μg/ml)的培养液培养96 h，采用实时PCR检测细胞RNA 中HCV RNA水平。图2A显示，利巴韦林剂量依赖性抑制HCV复制，1 μg/ml利巴韦林可显著降低HCV RNA水平(P<0.05)；且100 u/ml IFN-α联合利巴韦林对HCV的复制具有协同抑制作用，表现为HCV RNA水平显著降低(P<0.05)。进一步采用蛋白免疫印迹法检测HCV蛋白在上述处理条件下的表达情况。结果显示，HCV NS3和E2在HCVcc感染的Huh7.5.1 细胞中均表达，而在未感染细胞中无表达；利巴韦林对NS3和E2表达的抑制亦呈剂量依赖性，100 μg/ml利巴韦林或其与100 u/ml IFN-α联合应用可完全抑制NS3和E2表达(图2B)。

A: Huh7.5.1 cells infected with HCVcc were cultured in the media containing various doses of ribavirin or in combination with 100 u/ml IFN-α. Real-time PCR was performed on the extracted RNA. HCV RNA levels are shown as relative percentages of the HCVcc-untreated control. The data are expressed as the mean value and the standard deviation of triplicate experiments. *P<0.05 compared with the untreated control. B: Western blot analysis of HCV NS3 and E2 protein expressions was carried out on protein extracts from the Huh7.5.1 cells treated with ribavirin or IFN-α. β-actin is shown as a loading control. One representative experiment out of two is shown.

2.3 不同剂量IFN-α诱导IRF9和ISG15水平的比较

将检测IRF9和ISG15水平作为衡量IFN诱生抗病毒基因能力的指标。HCVcc感染的Huh7.5.1细胞用含低剂量IFN-α的培养液培养72 h后，抽提细胞RNA。实时PCR检测结果显示，在HCVcc感染的Huh7.5.1细胞，5～80 u/ml IFN-α可剂量依赖性诱生IRF9(图3A)。与IRF9相似，ISG15也被5～80 u/ml IFN-α剂量依赖性促进诱生，且ISG15水平增加明显高于IRF9(图3B)。有趣的是，100 u/ml IFN-α却导致IRF9和ISG15水平开始降低。

Huh7.5.1 cells infected with HCVcc were cultured in the media containing various doses of IFN-α. Real-time PCR was performed on the extracted RNA. mRNA levels of IRF9 (A) and ISG15 (B) after 72 h treatment with IFN-α in cells with and without HCVcc infection were detected. The data are expressed as the mean value and the standard deviation of triplicate experiments.

2.4 不同剂量利巴韦林联合IFN-α诱导IRF9和ISG15水平的比较

继续研究利巴韦林单独及联合IFN-α对IRF9和ISG15的影响。结果如图4所示，在HCVcc感染的Huh7.5.1细胞，用1和5 μg/ml利巴韦林孵育96 h并不促进IRF9和ISG15水平升高；用20 u/ml IFN-α孵育则明显促进IRF9和ISG15水平升高；而利巴韦林联合IFN-α对IRF9和ISG15诱生无促进作用。

Huh7.5.1 cells infected with HCVcc were cultured in the media containing various doses of ribavirin and IFN-α. Real-time PCR was performed on the extracted RNA. mRNA levels of IRF9 (A) and ISG15 (B) after 96 h treatment with ribavirin in cells with and without HCVcc infection were detected. The data are expressed as the mean value and the standard deviation of triplicate experiments.

3 讨论

目前，主要采用IFN联合利巴韦林治疗HCV感染。慢性HCV感染患者对该方案的持续病毒应答率平均为47%～54%，其中HCV基因1型约为40%，而基因2型为85%～90%，表现出较好的临床效应[10,11]。为进一步比较IFN-α和利巴韦林的抗病毒效应，本研究采用可模拟病毒天然感染的体外培养HCVcc为研究对象，探讨IFN-α、利巴韦林单独或联合应用对HCV RNA水平、蛋白表达及抗病毒基因的影响。实验结果表明，IFN-α和利巴韦林剂量依赖性抑制HCV复制，且IFN-α联合利巴韦林对HCV RNA水平及HCV NS3和E2蛋白表达具有协同抑制作用。此外，IFN-α可诱生IRF9和ISG15，而利巴韦林并不提高两者的水平。

IFN联合利巴韦林治疗HCV感染表现出较强的抗病毒效应，阐明两者的抗病毒分子机制对提高疗效具有重要意义。Rice等利用含全长HCV 1b复制子的细胞作为实验材料，比较IFN-α和IFN-λ对HCV复制的影响。结果发现，两者剂量依赖性抑制HCV复制[12]。有临床资料表明，对于感染HCV基因1型的患者，利巴韦林剂量为1 000 mg/d(体重≤75 kg)或1 200 mg/d(体重>75 kg)；对于感染其他基因型的绝大多数患者，利巴韦林剂量为800 mg/d即可维持满意的持续病毒应答率[13]。本实验则进一步研究IFN-α和(或)利巴韦林对感染性病毒HCVcc复制的影响。结果显示，100 u/ml IFN-α可显著降低HCV RNA水平。利巴韦林不仅剂量依赖性降低HCV RNA水平，还对NS3和E2蛋白的表达呈剂量依赖性抑制。此外，IFN-α联合利巴韦林对HCV RNA水平和蛋白表达均有协同抑制作用。本实验结果不仅与相关报道一致，还深入探讨了IFN-α、利巴韦林体外抗病毒作用的量-效关系。

IFN-α通过诱导一系列具有抗病毒作用的效应蛋白表达，在细胞内建立抗病毒状态，抑制病毒复制，从而发挥抗病毒效应[14]。因此，了解抗病毒基因在IFN治疗前后的变化，有助于从分子水平阐明IFN治疗HCV的机制。IFN-α持续作用时间与某些相关基因之间的关系也令人感兴趣。聚乙二醇IFN-α治疗前后慢性丙型肝炎患者肝脏切片的研究表明，对IFN-α治疗敏感的患者，IFN-α诱导ISG表达强烈上调；对其无效的患者，治疗前ISG已高水平表达，IFN-α处理并不能使其表达进一步增高[15]。本研究选择IRF9和ISG15作为评价IFN-α抗病毒效应的指标。结果显示，在HCVcc感染的Huh7.5.1细胞中，IFN-α在一定范围内剂量依赖性促进IRF9和ISG15 mRNA水平升高，且ISG15水平上升高于IRF9；而低剂量利巴韦林并不促进两者mRNA水平上升。此结果与最近的一篇报道一致[16]，但对IRF9和ISG15蛋白表达水平的影响仍有待研究。此外，100 u/ml IFN-α导致IRF9和ISG15水平开始降低的机制尚需进一步探讨。在前期实验中，我们发现1和5 μg/ml利巴韦林联合20 u/ml IFN-α对HCVcc复制具有协同抑制作用。本文在两者协同抑制HCVcc复制的基础上，继续研究低剂量利巴韦林和IFN-α对ISG表达的影响(图4)。结果表明，利巴韦林联合IFN-α对IRF9和ISG15诱生无促进作用。因此，IFN-α联合利巴韦林对HCV复制具有协同抑制作用，但两者具有不同调节抗病毒基因表达的能力。

综上所述，本研究初步揭示了IFN-α、利巴韦林体外抗病毒作用的量-效关系及两者诱导抗病毒基因的差异。作为大多数病毒的通用策略，HCV干预IFN介导的信号转导，抑制其诱导的抗病毒效应，允许病毒逃逸宿主免疫应答，从而建立感染。HCV可能拥有数种机制以拮抗IFN或利巴韦林的抗病毒效应。HCV与抗病毒药物相互作用的过程涉及多种病毒、宿主、信号分子和抗病毒基因产物的综合作用，深入理解HCV与抗病毒药物相互作用的分子机制将提高以IFN为基础治疗方案的疗效，形成新的治疗措施。

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