51例新生儿脐带血单纯疱疹病毒的检测

任鹏，姚娟，金艳，李法锦，汪晓婷，葛俊，江龙凤，赵蕾，吉阳，王明丽

1. 安徽医科大学微生物学教研室，合肥 230032； 2. 合肥市妇幼保健院，合肥 230001

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)属α疱疹病毒，直径110～120 nm，基因组为双链DNA，约150 kb。根据血清型，分为HSV-1和HSV-2，两者均可引起新生儿感染。孕早期感染HSV者因胚芽受破坏而流产；妊娠中、晚期感染者虽少发畸胎，但可引起胎儿和新生儿发病。孕期2种感染形式均可影响胎儿，特别是孕早期和分娩时首次感染可通过胎盘传播给胎儿。妊娠前20周首次感染可导致自然流产、死产和胎儿先天性畸形，特别是小头畸形、脑积水；妊娠中、晚期首次感染主要导致胎儿宫内发育迟缓[1]。因此，了解新生儿HSV感染情况，对指导新生儿HSV感染所致疾病的预防和治疗具有重要意义。本研究采集了合肥地区51例新生儿脐带血，通过套式聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测特异性HSV-1 gD基因和HSV-2 gG基因。PCR阳性扩增产物经测序后，通过美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)在线工具BLAST进行序列比对，确认HSV-1、HSV-2阳性标本，分析51例新生儿脐带血HSV感染情况。

1 材料和方法

1.1 研究对象

2010年11月～2011年6月，于某地妇幼保健院采集健康产妇顺产新生儿抗凝脐带血51份。

1.2 病毒株

HSV-1(F株)、HSV-2(Sav株)标准株[2]均为本室保存，用作阳性对照。

1.3 仪器和试剂

全血DNA抽提试剂盒购自北京索莱宝公司；DNA IQTMSystem-Small Sample Casework Protocol试剂盒购自Promega公司；试剂购自TaKaRa公司；梯度PCR仪为Biometra 公司产品。应用Gel Documentation System (Biosens SC 720)凝胶成像系统观察记录结果。引物合成和DNA测序均由上海Invitrogen公司完成。

1.4 实验方法

1.4.1标本采集新生儿脐带血无菌采自脐带近婴儿段，用医用无菌肝素抗凝管收集，每管3 ml。采集后，冰盒送实验室用于检测。

1.4.2DNA提取应用北京索莱宝公司全血DNA抽提试剂盒提取新生儿脐带血DNA，-20 ℃保存。抽提方法为DNA柱吸附洗脱法，操作按试剂盒详细说明进行。

1.4.3套式PCR检测新生儿脐带血HSVDNA特异性HSV-1 gD基因和HSV-2 gG基因套式PCR引物参考Lewensohn-Fuchs等[3]设计及使用(表1)。PCR反应体系为：10×Buffer 5 μl，2.5 mmol/L dNTP 4 μl，上下游引物80 pmol，Taq酶0.5 μl，DNA模板2 μl，用无菌去离子水补足50 μl。每次实验均设阴性对照(不加模板)。反应体系的配制、分装在超净工作台内进行。HSV套式PCR反应条件均为94 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、72 ℃终延伸10 min，外侧引物PCR 30个循环，内侧引物PCR 35个循环。PCR反应完成后，取5 μl产物用于2%琼脂糖凝胶电泳，并通过凝胶成像系统观察记录。阳性扩增产物测序后，通过NCBI在线工具BLAST进行序列比对。

1.5 统计学分析

使用SPSS 17.0进行统计学分析，计数资料采用χ2检验,P<0.05为有统计学意义。

表1 HSV套式PCR引物序列Tab.1 HSV nested-PCR primers

2 结果

2.1 新生儿脐带血HSV-1和HSV-2的检测

采集健康产妇顺产新生儿抗凝脐带血51份，应用HSV-1 gD基因特异性套式PCR引物检测标本，其中扩增阳性标本12份(图1A)。经测序并比对，发现扩增产物大小与引物设计大小一致，且均为HSV-1特异性产物。因此，51份脐带血标本中，HSV-1阳性率为23.53%，表明HSV-1感染率为23.53%(表2)。 应用HSV-2 gG基因特异性套式PCR引物检测51份脐带血标本，其中扩增阳性标本13份(图1B)。经测序并比对，发现扩增产物大小与引物设计大小一致，且均为HSV-2特异性产物。因此，51份脐带血标本中，HSV-2阳性率为25.49%，表明HSV-2感染率为25.49%。51份标本中，HSV-1和HSV-2共阳性标本4份，共感染率为7.84%。

M: marker DL2000; Lane 1: positive control; Lanes 2-7 specimens; Lane 8: negative control.

表2 新生儿脐带血HSV-1和HSV-2的检测Tab.2 Detection of HSV-1 and HSV-2 in neonatal cord blood

2.2 新生儿脐带血HSV-1和HSV-2感染率比较

51例新生儿脐带血HSV-2感染率略高于HSV-1，无统计学差异(表3)。

表3 51例新生儿脐带血中HSV-1和HSV-2检出率的比较Tab.3 Comparison of detection rate of HSV-1 and HSV-2 in neonatal cord blood

3 讨论

HSV先天性感染是导致新生儿出生缺陷的重要因素之一。有学者总结了30例先天性HSV感染患儿的临床特征，其中85%为低出生体重儿，36%为小于胎龄儿，67%有小头畸形、惊厥、弥散性脑损害、颅内钙化灶，57%有脉络膜视网膜炎、眼过小[3]。

新生儿HSV感染后早期临床表现多不典型，易误诊而延误治疗，因此实验室检测具有重要的诊断参考价值[4]。实验室诊断主要技术为病毒分离、培养及鉴定、PCR检测病原体DNA，以及特异性抗体检测。病毒分离、培养是实验室诊断的“金标准”，但耗时长，作为临床快速检测方法有一定缺陷。HSV特异性抗体检测可诊断新生儿HSV感染，但血清HSV IgG及IgM 抗体检测存在以下问题。(1)母亲经胎盘传递的IgG抗体影响结果判断。(2)特异性HSV IgM抗体在发病后2周才产生，达不到早期诊断的目的[5,6]。目前，PCR广泛应用于病原学检测，已成功用于脑脊液和血液中HSV DNA的检测[7]，使早期确诊、及时治疗成为可能。PCR扩增标本中的HSV DNA并测序，可确定标本中是否有HSV，是一种比较准确、有效的方法[8]。但在操作过程中易污染，结果需慎重对待。

HSV-1 US6编码gD糖蛋白。gD糖蛋白能与HveA、nectin 1和修饰后的硫酸肝素这3种细胞受体结合，从而决定病毒的细胞嗜性。HSV-2 US4编码gG糖蛋白。gG糖蛋白为属特异性糖蛋白，其抗体可用于HSV分型。HSV-1 gD基因和HSV-2 gG基因均为病毒晚期基因，在病毒DNA复制起始后，表达水平显著升高[9]，检测到晚期基因表达即可判断病毒感染为活动性感染。因此，本研究分别选择HSV-1gD基因和HSV-2gG基因作为套式PCR检测的病毒基因。

新生儿HSV感染的获得途径主要有3种：宫内感染、产时感染和产后感染[10]。在胎儿生长、发育过程中，物质通过胎盘进行交换，为胎儿生长、发育提供支持。胎盘内有母体和胎儿2套血液循环系统。母体动脉血经子宫螺旋动脉流入绒毛间隙，在此与绒毛内血管的胎儿血进行交换后，经子宫静脉流回母体。胎儿静脉血经脐动脉及其分支流入绒毛毛细血管，与绒毛间隙内的母体血进行物质交换后，经脐静脉回流至胎儿。母体和胎儿的血液在各自封闭管道内循环，进行物质交换，但互不相混。因此一般认为，脐带血检测能直接、准确反映新生儿血液中是否存在HSV；如检测到HSV，可认为新生儿HSV感染可能为垂直传播[11,12]。

O’Riordan和Whitley等报道，美国新生儿HSV感染的发病率高，占新生婴儿的1/5 000～1/3 500，每年大约有1 500名新生儿感染HSV。其他国家发病率略低，英国为1/6 500，瑞典为1/15 000，日本为1/17 000[13,14]。Brown等通过HSV分离方法检测202例新生儿，报道新生儿HSV感染率为5%(10/202)[15]。Kropp和Whitley等报道新生儿HSV宫内感染率为5%～9%[16,17]。Shyamala等报道在先天性白内障新生儿中HSV感染率为18%[18]。

本次研究发现 51份脐带血中HSV-1阳性12份，感染率23.53%；HSV-2阳性13份，感染率25.49%；HSV-1和HSV-2共阳性4份，共感染率7.84%。

本研究中，新生儿HSV感染率高于国外报道，可能原因如下。(1)标本例数过少和地域差异，需在以后工作中扩大筛查量。(2)套式PCR反应较敏感，且标本采集时如不谨慎操作可导致标本污染，有可能出现假阳性。因此，在以后工作中，除应增加标本量外，还应对新生儿及产妇进行HSV特异性抗体检测，以分析获得新生儿HSV感染率的准确数据。鉴于我国尚无针对新生儿HSV先天感染率的准确数据报道，本研究有利于提高临床工作者对新生儿HSV感染疾病预防和治疗的重视度，开展调查及加强早期诊断和治疗。

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