水源中肠道病毒及胃肠炎病毒检测方法的研究进展及意义

匡小舟，滕峥，张曦

上海市疾病预防控制中心，上海 200336

肠道病毒和胃肠炎病毒专性寄生于人类胃肠道，引起宿主细胞感染。其传播主要通过粪-口途径，感染病毒的患者可在每克粪便中排泄出105～1011个病毒颗粒[1]，因此在与排泄物直接接触的原水中病毒浓度往往较高。肠道病毒与胃肠炎病毒自身物理、化学性质稳定，不仅可在人类胃肠道内稳定生存，在水中存活时间也可长达数周[2,3]。虽然它们无法在水中直接复制，但一旦被摄入人体内，即使低剂量也能引起疾病[4]。因此，这些生存于污染环境水中的病毒对人类健康构成潜在威胁。例如，用于农业灌溉与施肥的废水和污水、污泥就是一种病毒污染农作物的可能来源和途径[5]，世界各地也曾多次出现由水源污染引起暴发流行的各种病毒性肠道疾病或腹泻事件[6,7]。

目前的污水处理程序，如活性沉渣处理、氧化塘、活性炭处理、过滤、石灰混凝及加氯，只能消除废水中50%～90%的病毒[8]，因此一些病毒仍能在污水处理后被排放。大多数国家对废水处理系统性能监测的指标主要依赖于指示性细菌。我国现行的《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)和废水再利用中的《再生水水质标准》(SL 368-2006)中微生物污染指标一栏也只包括了细菌和寄生虫的测定标准，并没有涵盖对涉水病毒的检测。但细菌与病毒污染并不一定有关联[9]，细菌指标的使用不足以用来监测和评价已处理水源的水质。目前病毒检测技术灵敏度不高，常规方法如荧光反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)只能在样品含高浓度病毒 (>2×104copies/ml)的情况下才能将其检出[10]。因此，通常情况下，水样在前处理过程中只有通过不同技术手段有效浓缩，才能检出并证实所含的污染病毒。在全球不少因病毒污染水源而造成腹泻暴发的流行病学调查中，实验室也都依赖病毒浓缩的方法，最终成功捕获到致病微生物并还原出原始感染模型。2009年6月，意大利南部的加尔达湖大酒店出现腹泻病情，当地公共卫生署在之后的4周内上报了几百起病例。实验室除对患者粪便进行检测外，还采集当地市区的引用水源(即经过理化处理的湖水)，将水样滤膜浓缩，用一步法RT-PCR进行检测，结果证实诺如病毒与这起水体传播暴发疫情有明显关联[11]。1998年在加勒比岛上的百慕大度假酒店暴发腹泻，影响了包括122名员工在内的至少448人。美国亚特兰大疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)实验室通过滤膜浓缩水源和RT-PCR分析，证明疫情与水箱被携带诺如病毒的粪便污染有关[12]。同年，通过类似对饮用水样本浓缩处理和RT-PCR检测，芬兰也确认了1起发生在黑奈韦西市的腹泻暴发是由于市政自来水被诺如病毒污染所致。据流行病学调查，这起事件涉及1 700～3 000例急性胃肠炎病例，再次印证饮用水的氯化处理不足以杀灭水体中的病毒[6]。以上调查研究都指出，如何对水体样本进行高效的病毒浓缩并对目标病原体进行特异性检测是确认疫情暴发起因的决定性因素。

1 肠道病毒与胃肠炎病毒

人肠道病毒属小核糖核酸病毒科肠道病毒属[13]，其亚属包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(A组、B组)、埃可病毒和一组由血清型号标记的肠道病毒(66～71型及新鉴定的73～75、77、78型)。肠道病毒颗粒由小的无包膜二十面体组成，直径只有27～30 nm。基因组由单股正链RNA组成，复制发生在脊椎动物细胞的细胞质内[14-16]。肠道病毒感染的特点是高异质性临床表现，同一种病毒可引起几种不同的临床疾病，而不同肠道病毒也可引起相同的临床症状[14]。脊髓灰质炎病毒通常引起亚临床感染或严重感染，如无菌性脑膜炎和脊髓灰质炎(小儿麻痹)[17]。柯萨奇病毒、埃可病毒及其他型别肠道病毒根据组别会引起不同的疾病症状，其中包括上呼吸道和胃肠道感染、黏膜疹、皮疹、疱疹性咽峡炎(手足口病)、出血性结膜炎，以及更严重的无菌性脑膜炎、脑炎、麻痹、胰岛素依赖型糖尿病和心脏疾病[16-18]。

引起人病毒性胃肠炎的病原体主要有轮状病毒、诺如病毒、札幌病毒、肠道腺病毒(血清型为F亚属的40、41型)和星状病毒等[19,20]。其中，轮状病毒是5岁以下儿童严重腹泻的主要病原体。在发展中国家，每年轮状病毒导致约140万病例，其中约80万例死亡，占所有腹泻入院患者的25%[21]。轮状病毒为直径约70 nm、无包膜的二十面体病毒，属呼肠孤病毒科。病毒颗粒由3层蛋白衣壳包裹的11段双链RNA组成[22]。病毒感染破坏了宿主小肠中上层绒毛上参与绒毛吸收功能的成熟肠上皮细胞，改变了小肠上皮的功能，助长了分泌型隐窝细胞的增殖，造成吸收不良性腹泻[23,24]。其经典症状是2～3 d的发热和呕吐，后伴有非出血性腹泻[25]。在发达国家和发展中国家儿童中，A群轮状病毒致急性胃肠炎最为常见。目前除通过疫苗接种预防外，还没有特定的治疗方法[26]。诺如病毒则是引起全球所有年龄组人急性病毒性胃肠炎的重要病原体[27]。诺如病毒和札幌病毒同属杯状病毒科，颗粒为无包膜的二十面体，包含1条约7.7 kb的单股正链RNA[28]。它引起的暴发呈季节性或散发性特征，尤其是在半封闭社区，如家庭、学校、养老院、医院、酒店、邮轮等[29]。与其他胃肠炎病毒不同，肠道腺病毒颗粒虽然也是由无包膜的二十面体衣壳组成(直径约90 nm)，但其基因组为34～48 kb的线性双链DNA[30]。在其纤维和五邻体衣壳蛋白的介导下，腺病毒感染宿主上皮细胞(消化道)，可能造成病毒广泛播散，并在儿童和免疫功能低下者中引起死亡[31]。星状病毒是引起婴幼儿急性病毒性肠炎的最重要病原体之一，直径28～35 nm，无包膜，为单股正链RNA[32]。星状病毒常与轮状病毒混合感染。与其他胃肠炎病毒相比，其临床表现较轻，腹泻持续时间较短[33]。

2 水样浓缩方法

与临床样本中的病毒载量相比，环境中的病毒浓度通常较低，因此成功浓缩并检测到环境样品中的致病病毒是一大挑战。不同国家对如何从水源中浓缩病毒都做了不少研究[34-37]，美国和欧盟也颁布了一系列指导性的标准和方法，如美国的D5244-92、9510及欧盟的BS EN 14486∶2005等。归纳起来，这些方法主要基于2种原理(表1)。一种是经离子结合的滤膜过滤浓缩，另一种是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀。

表1 2种从不同水样或模拟水样中浓缩并检测病毒的病毒浓缩法Tab.1 Two conventional virus enrichment methods for the detection of various viruses from different water samples

2.1 离子结合滤膜浓缩法

在离子结合滤膜浓缩病毒的方法中，水中病毒在多价阳离子存在的条件下，可吸附在负电性滤膜上。这种吸附可能不仅是由病毒、滤膜和阳离子三者间的静电吸引力引起的，还可能是三者疏水性相互作用的结果[44]。Lukasik等[44]在滤膜浓缩水中病毒的研究中证实，阳离子的存在促进病毒与滤膜间的疏水性作用，从而加强病毒吸附。此外，这些带阳离子的盐类对促进病毒吸附的能力还与其自身的化合价有关。同样浓度的三价盐(Al3+)对病毒吸附滤膜的促进能力强于二价盐(Mg2+)，而同样浓度的二价盐促进吸附的能力又强于单价盐(Na+)[45,46]。传统方法中，吸附在滤膜上的病毒可被碱性牛肉浸出液(1%～3%，pH 9～11)洗脱。但由于牛肉浸出液中的有机或无机化合物可能会抑制cDNA合成和PCR扩增[47,48]，所以另一种洗脱病毒的方法被不少学者采纳，即先用强酸(如H2SO4，pH 3.0)洗膜，然后用强碱(如NaOH，pH 10.8)洗脱病毒[37,38,49]。

2.2 PEG沉淀法

PEG沉淀法在20世纪60～70年代广泛运用于病毒的浓缩和提纯[50-52]。PEG是一种无毒、可溶于水、化学性质为惰性的合成聚合物，可用来沉淀蛋白(也包括由蛋白衣壳包裹的病毒颗粒)。其最主要的作用原理由Atha和Ingham提出：PEG就如“惰性溶液海绵”，在减少空间结构的基础上将蛋白从溶液中排出，从而有效增加蛋白浓度直至超过其饱和溶解度，最终蛋白从溶液中析出，出现沉淀[53]。此外，还有另一种可能的理论可解释PEG沉淀现象，即蛋白表面电荷对溶解的PEG产生一种不利的热学效应，导致PEG从“蛋白区域”被排斥出来。因此当PEG聚合物以适当的高浓度存在时，蛋白沉淀或蛋白结晶就会出现[54]。高相对分子质量的PEG浓缩、纯化病毒的效果比低相对分子质量的PEG更有效[41]。

3 检测方法

3.1 分子生物学方法

自20世纪90年代，分子生物学方法广泛应用于临床和环境研究以检测样本中的肠道病毒。PCR技术就是基于病毒基因组中肠道病毒属部分同源性高度保守区域而建立的，比传统借助细胞培养的检测分析更具优势。研究证明，PCR扩增在诊断肠道病毒感染中快速、特异、敏感[55]。通过使用不同的引物，可检测不同组或特定血清型的病毒[38]。因此，在样本稀少或病毒无法在细胞中诱导细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)的条件下，PCR灵敏度高，是一种可靠的检测手段[56]。但传统的PCR对确切估计测试样品中的病毒量还有一定局限性，所以一些PCR衍生技术被开发并运用，如套式PCR、多重PCR和实时荧光PCR，进一步提高了检测的灵敏度和特异度。

套式PCR使用了2对引物，分别是外部引物(目标序列两端的互补物)和内部引物(更接近于中心扩增片段的引物)。第1次扩增反应后，其产物立即作为第2次扩增的模板，因而增强了灵敏度和特异度[38,57]。而多重PCR允许用几对不同引物同时检测不同类型的病毒，但反应产物必须有不同的长度才能被区分[17]。实时定量PCR系统，在荧光探针和与目标序列互补的淬灭基团存在下，可实现同步监测运行时的反应情况。随着测得的PCR产物数量增加，荧光信号随之加强，并通过图谱形式呈现在计算机上。由于其无法比拟的快速和高特异度，以及可对目标病毒基因实现半定量测定，不少研究将其用于检测水体中的肠道病毒[37,55]。

3.2 细胞培养法

虽然PCR技术在很大程度上提高了水体中肠道病毒的检出率，但其无法对样本中病原体的存活性乃至感染性作出有效评估，此外也无法对不同浓缩病毒方法就病毒活性影响方面作出比较性判断。因此，病毒培养和分离作为诊断肠道病毒感染的“金标准”，无论是单独检测还是结合分子生物学方法综合判断，都是一道不可缺少的程序[38,58]。有几种较常用的、直接基于细胞培养法测得的指标可用于判断病毒的感染性：一种是病毒在易感细胞中的半数感染剂量(50% tissue culture infective dose，TCID50)，另一种则是通过蚀斑试验得到的空斑形成单位(plaque forming unit，PFU)。

传统实验中，肠道病毒根据不同型别，可通过RD、HEP-2、L20B、VERO、HeLa、BGM等易感细胞系进行培养[10,56,57]。当选定的细胞被感染后，CPE的出现就可作为评估病毒是否具有感染性的指标之一。TCID50终点稀释测试量化了杀死50%受感染细胞或在50%细胞中出现CPE所需的病毒数量。值得一提的是，该实验还可用来评估不能形成蚀斑的病毒感染性。在细胞培养中，首先将宿主细胞铺于培养板上，随后将经连续稀释的病毒逐一滴加于不同孔板，孵育后对每个病毒稀释度观察并记录细胞死亡比例(感染细胞)，通过公式计算获得TCID50值[59]。

基于蚀斑的检测，就感染剂量而言是判断病毒浓度所采用的标准方法，用PFU表示。在实验中，将不同稀释度的病毒感染单层宿主细胞，并用半固体培养基覆盖(如琼脂或羧甲基纤维素)以有效防止病毒泛滥性蔓延感染。在固定单层细胞内，当病毒感染某个细胞后，该细胞会裂解，病毒空斑就此形成[60]。破胞释放的病毒继而进入相邻细胞，在细胞内重复从感染到裂解的周期。被感染的细胞区域会形成蚀斑(感染区被未感染的细胞包围)，此现象在指示剂染色后可通过肉眼或光学显微镜观察到。斑块的形成可能需要3～14 d，这取决于不同的病毒。斑块数量结合病毒稀释度，可用来计算样本每单位体积的PFU(PFU/ml)。该结果基于每个斑块代表1个感染病毒颗粒的假设，体现了样本内感染颗粒的数量[59]。由于检测方法和原理的显著差异，PFU与TCID50的检测结果不等价，PFU能更直接估算出浓缩后样品中的感染颗粒数量。

4 结语

随着科技发展，越来越多的研究开始运用水体浓缩、纯化手段，结合分子生物学和细胞培养方法，检测环境水体样本中的肠道病毒。这些技术不但实现了传统方法无法完成的检测，填补了传染病实验室在检测环境标本中的技术空缺，而且为病毒性肠道疾病疫情的流行病学资料提供了实质性证据。但是，我国现行的《生活饮用水卫生标准 》(GB 5749-2006 )和废水再利用中的《再生水水质标准》(SL 368-2006)中微生物污染指标一栏只包括细菌和寄生虫的测定，没有涉及水病毒的检测标准规程。因此，这些国内外的有关研究对我国行业标准制定部门将有所启示，为今后疾病预防和控制单位的实验研究和应用起指导作用。

[1] Bosch A. Human enteric viruses in the water environment: A minireview [J]. Int Microbiol, 1998, 1(3): 191-196.

[2] Lo S, Gilbert J, Hetrick F. Stability of human enteroviruses in estuarine and marine water [J]. Appl Environ Microbiol, 1976, 32(2): 245-249.

[3] Abad FX, Pintó R, Villena C, Gajardo R, Bosch A. Astrovirus survival in drinking water [J]. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(8): 3119-3122.

[4] Li WJ, Wang XW,, Rui QY, Song N, Zhang FG, Ou YC, Chao FH. A new and simple method for concentration of enteric virus from water [J]. J Virol Methods, 1998, 74(1): 99-108.

[5] Metcalf TG, Melnick JL, Estes MK. Environmental virology: from detection of virus in sewage and water by isolation to identification by molecular biology—a trip of over 50 years [J]. Annu Rev Microbiol, 1995, 49: 461-487.

[6] Kukkula M, Maunula L, Silvennoinen E, von Bonsdorff CH. Outbreak of viral gastroenteritis due to drinking water contaminated by Norwalk-like viruses [J]. J Infect Dis, 1999, 180(6): 1771-1776.

[7] Chobe LP, Arankalle VA. Investigation of a hepatitis A outbreak from Shimla Himachal Pradesh [J]. Indian J Med Res, 2009, 130(2): 179-184.

[8] Cloette TE, Da Silva E, Nel LH. Removal of waterborne human enteric viruses and coliphages with oxidized coal [J]. Curr Microbiol, 1998, 37(1): 23-27.

[9] He JW, Jiang S. Quantification of enterococci and human adenoviruses in environmental samples by real-time PCR [J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(5): 2250-2255.

[10] Kageyama T, Kojima S, Shinohara M, Uchida K, Fukushi S, Hoshino FB, Takeda N, Katayama K. Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(4): 1548-1557.

[11] Di Bartolo I, Monini M, Losio MN, Pavoni E, Lavazza A, Ruggeri FM. Molecular characterization of Noroviruses and rotaviruses involved in a large outbreak of gastroenteritis in Northern Italy [J]. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(15): 5545-5548.

[12] Brown CM, Cann JW, Simons G, Fankhauser RL, Thomas W, Parashar UD, Lewis MJ. Outbreak of Norwalk virus in a Caribbean island resort: application of molecular diagnostics to ascertain the vehicle of infection [J]. Epidemiol Infect, 2001, 126(3): 425-432.

[13] Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Update on vaccine-derived polioviruses—worldwide, July 2009-March 2011 [J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2011, 60(25): 846-850.

[14] Bernit E, de Lamballerie X, Zandotti C, Berger P, Veit V, Schleinitz N, de Micco P, Harlé JR, Charrel RN. Prospective investigation of a large outbreak of meningitis due to echovirus 30 during summer 2000 in Marseilles, France [J]. Medicine (Baltimore), 2004, 83(4): 245-253.

[15] Khetsuriani N, Lamonte-Fowlkes A, Oberst S, Pallansch MA, Centers for Disease Control and Prevention. Enterovirus surveillance—United States, 1970-2005 [J]. MMWR Surveill Summ, 2006, 55(8): 1-20.

[16] Rajtar B, Majek M, Polański, Polz-Dacewicz M. Enteroviruses in water environment—a potential threat to public health [J]. Ann Agric Environ Med, 2008, 15(2):199-203.

[17] Fong TT, Lipp EK. Enteric viruses of humans and animals in aquatic environments: health risks, detection, and potential water quality assessment tools [J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2005, 69(2): 357-371.

[18] Kmetzsch CI, Balkie EM, Monteiro A, Costa EV, dos Santos GP, da Silva EE. Echovirus 13 aseptic meningitis,Brazil [J]. Emerg Infect Dis, 2006, 12(8): 1289-1290.

[19] Logan C, O’Leary JJ, O’Sullivan N. Real-time reverse transcription PCR detection of norovirus, sapovirus and astrovirus as causative agents of acute viral gastroenteritis [J]. J Virol Methods, 2007, 146(1-2): 36-44.

[20] Logan C, O’Leary JJ, O’Sullivan N. Real-time reverse transcription-PCR for detection of rotavirus and adenovirus as causative agents of acute viral gastroenteritis in children [J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(9): 3189-3195.

[21] Steele AD, Peenze I, de Beer MC, Pager CT, Yeats J, Potgieter N, Ramsaroop U, Page NA, Mitchell JO, Geyer A, Bos P, Alexander JJ. Anticipating rotavirus vaccines: epidemiology and surveillance of rotavirus in South Africa [J]. Vaccine, 2003, 21(5-6): 354-360.

[22] Dennehy PH. Rotavirus vaccines—an update [J]. Vaccine, 2007, 25(16): 3137-3141.

[23] Burke B, Desselberger U. Rotavirus pathogenicity [J]. Virology, 1996, 218(2): 299-305.

[24] Ramig RF. Pathogenesis of intestinal and systemic rotavirus infection [J]. J Viol, 2004, 78(19): 10213-10220.

[25] Anderson EJ, Webber SG. Rotavirus infection in adults [J]. Lancet Infect Dis, 2004, 4(2): 91-99.

[26] Parashar UD, Gibson CJ, Bresee JS, Glass RI. Rotavirus and severe childhood diarrhea [J]. Emerg Infect Dis, 2006, 12(2): 304-306.

[27] Hutson AM, Atmar RL, Estes MK. Norovirus disease: changing epidemiology and host susceptibility factors [J]. Trends Microbiol, 2004, 12(6): 279-287.

[28] Carter MJ. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection [J]. J Appl Microbiol, 2005, 98(6): 1354-1380.

[29] Maguire AJ, Green J, Brown DW, Desselberger U, Gray JJ. Molecular epidemiology of outbreaks of gastroenteritis associated with small round-structured viruses in east Anglia, United Kingdom, during the 1996-1997 season [J]. J Clin Microbiol, 1999, 37(1): 81-89.

[30] Kajon AE, Moseley JM, Metzgar D, Huong HS, Wadleigh A, Ryan MA, Russell KL. Molecular epidemiology of adenovirus type 4 infections in US military recruits in the Postvaccination Era (1997-2003) [J]. J Infect Dis, 2007, 196(1): 67-75.

[31] Echavarria M, Forman M, van Tol MJ, Vossen JM, Charache P, Kroes AC. Prediction of severe disseminated adenovirus infection by serum PCR [J]. Lancet, 2001, 358(9279): 384-385.

[32] Clark B, McKendrick M. A review of viral gastroenteritis [J]. Curr Opin Infect Dis, 2004, 17(5): 461-469.

[33] Espul C, Martínez N, Noel JS, Cuello H, Abrile C, Grucci S, Glass R, Berke T, Matson DO. Prevalence and characterization of astroviruses in Argentinean children with acute gastroenteritis [J]. J Med Virol, 2004, 72(1): 75-82.

[34] Haramoto E, Katayama H, Ohgaki S. Detection of Noroviruses in tap water in Japan by means of a new method for concentrating enteric viruses in large volumes of freshwater [J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(4): 2154-2160.

[35] Westrell T, Teunis P, van den Berg H, Lodder W, Ketelaars H, Stenström TA, de Roda Husman AM. Short- and long-term variations of norovirus concentrations in the Meuse river during a 2-year study period [J]. Water Res, 2006, 40(14): 2613-2620.

[36] Villar LM, de Paula VS, Diniz-Mendes L, Lampe E, Gaspar AM. Evaluation of methods used to concentrate and detect hepatitis A virus in water samples [J]. J Virol Methods, 2006, 137(2): 169-176.

[37] Haramoto E, Katayama H, Oguma K, Ohgaki S. Recovery of naked viral genomes in water by virus concentration methods [J]. J Virol Methods, 2007, 142(1-2): 169-173.

[38] Katayama H, Shimasaki A, Ohgaki S. Development of a virus concentration method and its application to detection of enterovirus and Norwalk virus from coastal seawater [J]. Appl Environ Microbiol, 2002, 68(3): 1033-1039.

[39] Morsy El-Senousy W, Guix S, Abid I, Pintó RM, Bosch A. Removal of astrovirus from water and sewage treatment plants, evaluated by a competitive reverse transcription-PCR [J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(1): 164-167.

[40] Denis-Mize K, Fout GS, Dahling DR, Francy DS. Detection of human enteric viruses in stream water with RT-PCR and cell culture[J]. J Water Health, 2004, 2(1): 37-47.

[41] 赖众，赵玫，贾玉芳，叶萌. 聚乙二醇浓缩纯化脊髓灰质炎病毒的效果[J]. 云南医药, 1986, 7(5): 298-300.

[42] 张文清, 马文煜, 骆文静, 姜绍谆, 胡艳冰, 侯悦, 张进, 于碧云. PEG6000 沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒[J]. 第四军医大学学报, 2000, 21(1): 38-40.

[43] Deboosere N, Horm SV, Pinon A, Gachet J, Coldefy C, Buchy P, Vialette M. Development and validation of a concentration method for the detection of influenza A viruses from large volumes of surface water [J]. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(11): 3802-3808.

[44] Lukasik J, Scott TM, Andryshak D, Farrah SR. Influence of salts on virus adsorption to microporous filters [J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(7): 2914-2920.

[45] Wallis C, Melnick JL, Gerba CP. Concentration of viruses from water by membrane chromatography [J]. Annu Rev Microbiol, 1979, 33: 413-437.

[46] Gerba CP. Applied and theoretical aspects of virus adsorption to surfaces [J]. Adv Appl Microbiol, 1984, 30: 133-68.

[47] Abbaszadegan M, Huber MS, Gerba CP, Pepper IL. Detection of enteroviruses in groundwater with the polymerase chain reaction [J]. Appl Environ Microbiol, 1993, 59(5): 1318-1324.

[48] Schwab KJ, De Leon R, Sobsey MD. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for detection of enteroviruses, hepatitis A viruses, and Norwalk viruses by reverse transcription-PCR [J]. Appl Environ Microbiol, 1995, 61(2): 531-537.

[49] Hata A, Katayama H, Kitajima M, Visvanathan C, Nol C, Furumai H. Validation of internal controls for extraction and amplification of nucleic acids from enteric viruses in water samples [J]. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(13): 4336-4343.

[50] 李六金. 应用聚乙二醇浓缩和提纯虫媒披盖病毒抗原的进展[J]. 中国人民解放军兽医大学学报, 1982, 2(1):85-90.

[51] Horzinek M. A simple method for concentration of arboviruses propagated in tissue culture [J]. Am J Trop Med Hyg, 1969, 18(4): 588-591.

[52] Igarashi A, Fukuoka T, Sasao F, Surimarut S, Fukai K. Purification of Japanese encephalitis virus grown in BHK21 and Singh’s Aedes albopictus cells by polyethylene glycol precipitation [J]. Biken J, 1973, 16(2): 67-73.

[53] Atha DH, Ingham KC. Mechanism of precipitation of proteins by polyethylene glycols: analysis in terms of excluded volumes [J]. J Biol Chem, 1981, 256(23): 12108-12117.

[54] Lee JC, Lee LL. Preferential solvent interactions between proteins and polyethylene glycols [J]. J Biol Chem, 1981, 256(2): 625-631.

[55] Pusch D, Ihle S, Lebuhn M, Graeber I, López-Pila JM. Quantitative detection of enteroviruses in activated sludge by cell culture and real-time RT-PCR using paramagnetic capturing [J]. J Water Health, 2005, 3(3): 313-324.

[56] Lee HK, Jeong YS. Comparison of total culturable virus assay and multiplex integrated cell culture-PCR for reliability of waterborne virus detection [J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(6): 3632-3636.

[57] Ehlers MM, Grabow WO, Pavlov DN. Detection of enteroviruses in untreated and treated drinking water supplies in South Africa [J]. Water Res, 2005, 39(11): 2253-2258.

[58] Kim HJ, Shin YO, Kim SH. Detection of enteroviruses and mammalian reoviruses in Korean environmental waters [J]. Microbiol Immunol, 2006, 50(10): 781-786.

[59] Flint SJ, Enquist LW, Racaniello VR, Skalka AM. Principles of Virology [M]. 3rd ed. Washington, DC: ASM Press, 2009.

[60] Kaufmann SH, Kabelitz D. Methods in Microbiology [M]. 2nd ed. London: Academic Press, 2002.