肿瘤干细胞及其耐药性机制研究

韩宜男 钱江

造血系统恶性肿瘤起源于干细胞样细胞，这一理论的建立改变了人们对于肿瘤发生学及化学治疗的传统看法［1］。随后在乳腺癌、神经系统肿瘤及其他非造血系统的实体肿瘤中，也陆续证实，存在着具有自我更新能力、能特异性分化成器官各种组成成分的多能干细胞，促使人们更深入地进行肿瘤干细胞的生物学研究［2-3］。这些具有与正常干细胞相似特性的干细胞样细胞，或称为“肿瘤干细胞”群体的存在，暗示了肿瘤的真正来源［4］。现今肿瘤的化学治疗虽然能成功地缩小许多实体肿瘤的负荷，消灭快速增殖的细胞，却难以达到根治。其失败的根源可能就是忽略了针对肿瘤增殖池的清除，为日后的复发和转移埋下隐患。基于正常干细胞具备天然抗药性特点的推测，肿瘤对于化疗药物的耐药性可能也与肿瘤干细胞的耐药特性相关。本综述尝试找出肿瘤干细胞与肿瘤耐药性之间的相关联系，从而指导临床上肿瘤化学治疗方案的选择，并为开发新型抗癌药物提供方向。

1 肿瘤的耐药机制

目前认为，肿瘤的耐药机制主要分为两大类。第1类表现为抗癌药物的转运过程受损。这可能源于机体对口服药物吸收不良或代谢清除增强，导致血药浓度降低，从而减少了抗癌药从血液向肿瘤组织的弥散作用［5-6］。也有研究［7］强调肿瘤血管化程度及合适的压力梯度对于充足药物转运的重要性。此外微环境因素，如细胞外基质及肿瘤生长的几何形状等，都可能对肿瘤细胞的耐药性产生影响［5］。由于这一类耐药机制与机体对药物的影响有关，又称为药理耐药(pharmacological resistance)［8］。第2 类称为生化耐药(biochemical resistance)，是指肿瘤细胞的遗传性及生化特性发生复杂的变化，从而影响自身对药物的敏感度。体外培养的肿瘤细胞很容易通过改变药物作用靶点或增强对药物诱导损伤(多为DNA损伤)的修复而达到对一种或一类药物耐药［9］。令人惊奇的是，经过单种药物耐药筛选之后的肿瘤细胞系，往往表现出对其他结构和作用机制毫不相干药物的交叉耐药。这种现象称为“多重耐药性(multidrug resistance，MDR)”，进而解释了那些结合不同作用靶点药物的治疗方案并不比单药治疗更有效的原因。

在最初探讨肿瘤交叉耐药机制的研究中，Ling等［10］发现了一个现象，即耐药细胞的细胞膜表现出对细胞毒化合物的通透性降低。随着分子技术的进步，第1个MDR后选基因被分离出来。Roninson等［11］假设，经过药物筛选的细胞产生耐药性是因为扩增了某些决定细胞膜功能的基因产物。由于注意到耐药的仓鼠细胞系中常常出现遗传异常，他们克隆了这些被扩增的片段，发现只有在耐药细胞中存在这些片段的基因或基因编码扩增，而在易感细胞中则无此现象。去除选择压力后，耐药细胞也恢复对药物敏感的表型，伴随着DNA扩增的消失。之后，实验的不断深入使越来越多的MDR基因被公之于世，其中最为熟悉的就是ATP结合盒基因(ATP-binding cassette genes，ABC基因)。到2001年为止，被证实的人ABC基因已达到48个。人们基于序列同源性和域结构的差异，又进一步将这个庞大的家族划分成7个不同的亚家族(ABCA-ABCG)。这一大类基因编码的正是ABC转运子(ATP-binding cassette transporters)，它们利用ATP水解所得的能量，主动将药物泵出细胞，降低胞内药物浓度，从而保护其不受细胞毒物质的损害，使细胞产生耐药性。由于这类转运子具有泛宿主性及对药物的低特异性，因此成为肿瘤细胞多重耐药最常见的分子基础。受ABC转运子影响的抗癌药物包括长春花生物碱类(长春碱及长春新碱)、蒽环类(多柔比星及柔红霉素)、RNA转录抑制剂放线菌素-D及微管稳定药物紫杉醇。

减少药物摄取也可介导耐药性的产生。搭载着平时用于运载营养物质的转运子进入细胞的水溶性药物，以及通过胞吞作用入胞的物质，即使在没有证据证明存在外流增加的情况下，在细胞内也可能无法积蓄。此类药物包括叶酸拮抗剂甲胺蝶呤，核苷酸类似物如5-氟胞嘧啶、顺铂等。

MDR还可源于协同调节解毒系统(如DNA修复及细胞色素P450多功能氧化酶类)的活化。事实上，多药转运蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein，PGP)与细胞色素P450 3A的协同诱导现象已经在研究中观测到［12］。这种的MDR性可在暴露于任何药物后被诱导产生。近年来有证据提示特定的孤核受体，如SXR，可能涉及介导这种对环境压力的总体反应［13］。

最后，耐药性的产生还可能是凋亡途径缺失的结果。这在恶性转化中较为多见。促凋亡基因(如p53)的突变或功能缺失，或抗凋亡基因(如bcl-2)的过度表达，都将相应导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐药。细胞在化学药物的选择压力之下还可能通过改变神经酰胺水平［14］、改变细胞周期的调控机制而阻止凋亡的产生。

综上所述，第2类耐药机制的一个重要原理就是:肿瘤细胞具备遗传异质性。虽然肿瘤的克隆扩增过程导致了细胞的失控生长，但暴露于化疗药物的肿瘤细胞，将凭借自身的生存能力被选择性保留下来并与细胞毒性药物共存。这些残留的肿瘤细胞很可能因为具有突变物的显型而表现出遗传异质性。因此，任何经过化疗的肿瘤细胞都可能产生不只一种耐药机制。这种现象称为“多因素的多重耐药性(multifactorial multidrug resistance)”［9］。

2 肿瘤干细胞理论与肿瘤耐药机制

正常干细胞除了具备自我更新及分化潜能之外，还保留着其他区别于成熟分化细胞的特质，使其能获得相当长的寿命。这些特质包括:大部分时间处于静止状态、表达多种ABC转运子从而抵抗药物和毒物的损害;同时具有DNA修复能力和抗凋亡能力。干细胞的生存也离不开其他细胞、基质及生长因子组成的特定微环境，即干细胞的小生态环境(niche)［15］。

在干细胞的这些特质中，一个引人入胜而被广泛关注的是它们高水平表达某些特异性ABC药物转运子。例如造血干细胞表达高水平的ABCG2，但在大部分定向前体细胞和成熟血细胞中该基因却被关闭［16］。其中ABCB1、ABCC1及ABCG2被认定为3个最基本代表肿瘤MDR性的基因。这些泛宿主存在的ABC转运子超家族中的成员，能同时转运亲水和疏水化合物，在许多生理屏障间的物质转运中也起重要作用［17］。干细胞通过ABC转运子获得的药物转运特性是分离和分析干细胞的重要标志。已知大部分细胞能积蓄荧光染料，如Hoechst 33342和若丹明123(rhodamine 123，R123)，而它们又分别是ABCG2和ABCB1的底物;因此干细胞能通过这2种ABC转运子的外泵作用，将两者排出细胞而不着色，进而与普通细胞分离。这些不被染色的细胞又称为边群细胞［18］。大部分干细胞都是在边群细胞群内被发现的。

在许多肿瘤中已证实存在边群细胞［19］。这部分肿瘤细胞和正常干细胞之间的相似性，使人们提出肿瘤干细胞的理论［20-21］。认识到MDR转运子在保护正常干细胞中扮演的重要角色，可帮助人们进一步完善此理论，并加入了可能解释肿瘤治疗失败、晚期复发、转移和组织特异性区别的新见解。这一认识还可进一步指导人们利用肿瘤和正常干细胞之间的相似及差异，设计合理治疗方案。基于此理论，现今对于肿瘤细胞耐药性的获取模式存在以下几种假设。

1)肿瘤起始细胞是一种组织干细胞，具有许多与正常干细胞相似的特性，如自我更新、自我保护、耐受损伤等。复杂的向肿瘤转变过程始于循环中的组织干细胞突变。正常情况下，组织干细胞在结构上具有MDR活性;但一旦进入细胞周期，MDR就被暂时下调，导致DNA易受损伤的窗口期。在不对称分裂的过程中，循环干细胞自我复制，生成一个有MDR保护的静止期干细胞和一个对药物敏感、具有高度增殖能力的扩增前体细胞。当子代干细胞受损后，它将退出细胞周期并同时回归MDR保护状态;而当前体细胞受损后，便扩增形成大量对药物敏感的异常发育细胞。随着更多突变和遗传不稳定性在受损干细胞中累积，导致进一步生长失调，最终形成肿瘤。可以看出，在这一过程中肿瘤干细胞始终处于被保护的状态并极少进入细胞周期。大量的肿瘤实体是源于分裂活跃、对药物敏感的扩增前体细胞。当暴露于各种为MDR底物的抗肿瘤物质时，这些对药物敏感的肿瘤细胞被清除，但处于静止期的肿瘤干细胞却极少受影响［22］。这一假设模式同样令肿瘤干细胞得以将长期突变累积的各种耐药性传给它们异常发育的后代。例如，人白血病及淋巴瘤细胞中ABCB1表达上调的遗传改变就可能起源于干细胞。

2)肿瘤干细胞及其亲近子代在选择压力下突变导致MDR转运子过表达，使肿瘤前体细胞获得耐药表型，并繁衍出一批具备MDR的肿瘤细胞。这些细胞已在许多化疗后复发的肿瘤患者体内被发现。

3)肿瘤干细胞和各种分化细胞都天生具有耐药性，因此化疗收效甚微或不起作用，导致肿瘤生长。后者可在固有耐药的肿瘤，如肾细胞癌中得到例证。肾细胞癌的所有细胞都表达ABCB1，并因此对化疗药物耐受。在这个例证中，肿瘤干细胞的耐药表型持续存在于组成肿瘤细胞增殖池的、发育异常的定向祖细胞中［4］。

上述假设中强调了ABC转运子在干细胞耐药机制中的地位，但它却不是产生耐药的唯一决定因素。因为干细胞的DNA修复能力及抗凋亡机制具有同等重要地位。在肿瘤干细胞研究中，CD133通常被视作它的一个重要标志［3］，许多实验都是通过CD133+细胞与CD133－细胞之间的比较，来探讨肿瘤干细胞的特性。Todaro等［23］研究认为结肠癌的CD133+细胞可通过产生和利用白细胞介素4来保护自身，抵抗凋亡。Ma等［24］则提出肝细胞肝癌中CD133+细胞可通过活化Akt/PKB及bcl-2抗凋亡途径，增加自身在肿瘤组织中的含量，从而使肿瘤获得耐药性。Annabi等［25］还发现U87神经胶质瘤的CD133+细胞中，环氧化酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)的表达增加。COX-2是前列腺素亚型(PGE2)合成酶，而PGE2被认为能抑制肿瘤细胞的凋亡［26］。这些研究虽然具有局限性，但从一个侧面也反映肿瘤干细胞抗凋亡的机制对于其获得耐药的重要性。

3 结语

肿瘤的耐药性被视为化学治疗中的最大障碍。当前肿瘤化疗失败的根源可能是对治疗靶点的错误选择。肿瘤干细胞理论的出现，不仅使人们重新认识了肿瘤的发生机制及生物学行为，更使肿瘤治疗进入了一个新的领域。与正常干细胞相似，肿瘤干细胞也具有独特的抵抗药物及毒物损害机制，因而可能成为肿瘤难治性基础。对于肿瘤耐药性的研究，尤其是分析肿瘤干细胞与其之间的关系，对于推动肿瘤化学治疗的发展具有重要意义。本文综述的各种肿瘤细胞获得耐药性的，都可能成为今后化学治疗的靶点。同时寻找出正常干细胞与肿瘤干细胞之间的差异，设计更具针对性的抗肿瘤药物，也将成为今后肿瘤化疗发展中的难点和重点。

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