苗医验方“四大血”抗炎、镇痛作用研究△

田振华 谢达莎 包雪爱 张 斌 张 逊

(贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002)

“四大血”是在民族医药调研工作中搜集到的一个苗药验方，该方在黔北、川南、渝南山区广为流传，其治症广泛，常用于治疗风湿疼痛，跌打损伤、血瘀月经不调、瘫痪等病症，是苗医通气散血治疗法的代表性方剂［1］。“四大血”由苗药nangx dlob ghat(仰嗟嘎)、hsob hxangt(梭向)、ghab jongx bel sob xok(嘎龚布梭学)和vob mongb dlenb(莴蒙棱)等藤本药材以一定比例组成。广泛用于治疗气阻血瘀所引起的各种病症，为苗医常用验方。本课题通过二甲苯致小鼠耳肿胀、棉球致小鼠肉芽肿及扭体法、热板法等药理实验对该方的水提物和醇提物进行了抗炎、镇痛的药理研究。

1 实验材料

1.1 实验动物：昆明种小鼠，体重18～22g，SPF动物，许可证号为SCXK(渝)2007－0006，由重庆市中药研究院实验动物研究所提供。饲养条件：室温20～25℃，相对湿度50% ～60%。予固体饲料，自由饮水。

1.2 实验药液制备

1.2.1 醇提液制备：按“四大血”处方比例分别称取药材并粉碎成粗粉，用75%乙醇加热回流提取三次，合并滤液，回收乙醇至无醇味，继续浓缩至干，粉碎过120目筛备用。经计算干粉相当于原生药7.583g/g。临用时取干粉用蒸馏水加适量吐温－80配制成所需浓度的混悬液即可。

1.2.2 水提液制备：按“四大血”处方比例分别称取药材并粉碎成粗粉，用自来水煎煮3次，合并滤液。浓缩至2g/ml原生药，临用时加蒸馏水配制成相应的浓度即可。

1.3 药品与试剂：“四大血”的水、醇提取物均由本课题成员制备(提取方法见1.2)。痛舒胶囊(TSJN，下同)，国药准字Z2005478，批号：090507(云南药物研究所制药厂)，临用时用蒸馏水配制成溶液使用。0.9%氯化钠注射液，批号：090826(贵州科伦药业有限公司)。所用试剂0.6%醋酸，二甲苯，0.1%伊文思蓝，1%角叉菜胶，3%戊巴比妥钠等由贵阳中医学院药理教研室提供。

1.4 仪器：电子天枰(BS110S型，北京赛多利斯仪器系统有限公司)，YLS6B智能热板仪(上海特惠仪器设备有限公司)，TG16－W型离心机(上海隆白生物科技有限公司)，752紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，数显游标卡尺(中美得力工具有限公司)。

2 实验方法

2.1 抗炎作用研究

2.1.1 对二甲苯致小鼠耳廓炎症的影响［2］：取体重18～22g昆明种小鼠80只，雄性，随机分成8组，每组10只。第1组为阴性对照组，每只动物给予等体积的生理盐水;第 2、3、4 组按 4.0g/kg，2.0g/kg，1.0g/kg 原生药的高、中、低剂量给予“四大血”水提物;第 5、6、7 组按 0.3g/kg，0.2g/kg，0.1g/kg的高、中、低剂量给予“四大血”醇提物，第8组为阳性对照组，每只动物按0.4g/kg的剂量给予TSJN溶液;灌胃给药，每日1次，连续3d。于末次给药45 min后，用微细针管将二甲苯0.04ml/只均匀涂在右耳前后两面致炎，40 min后颈椎脱臼法处死小鼠，立即剪下双耳，用直径8mm打孔器分别在左右耳相同部位取下耳片，用电子分析天平称重。以左右耳差值作为肿胀度，并按下式计算抑制率(%)。

2.1.2 对小鼠棉球肉芽肿增生的影响［3］：取体重18～22g的昆明种小鼠80只，雌雄各半，随机分为8组，分组与给药方式同2.1.1。给药前腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg麻醉小鼠，仰卧固定，酒精消毒下腹部皮肤，沿腹中线剪开长约0.5cm切口，将2个灭菌棉球(每个棉球重10mg，高压灭菌，分别滴加800u/ml青霉素和650u/ml链霉素各0.05ml，50℃烘干)分别植入小鼠左、右蹊部皮下。术后当日开始给药，每日1次，连续7d。末次给药后1h脱颈处死动物，将棉球连同周围结缔组织一起取出，剔除脂肪组织，于80℃烘箱12h烘干，冷却后称重。干重减去原棉球重量，即得肉芽组织重量。肉芽肿指数以mg(肉芽肿)/10g(体重)表示。

2.1.3 对小鼠毛细血管通透性的影响［4］：取体重18～22g的昆明种小鼠80只雄鼠，随机分为8组，分组与给药方式同2.1.1，连续给药3d。于末次给药后40 min，尾静脉注射1%伊文思兰0.1ml/10g，同时腹腔注射0.6%醋酸0.2ml/只，20min后脱颈处死，剪开腹腔用10ml生理盐水反复冲洗腹腔，用吸管吸取腹腔洗出液，于 3000r/min离心10min，取上清液，用分光光度计于590nm处测吸光度。

2.2 镇痛作用研究［4］

2.2.1 对小鼠痛阈的影响 热板法：取体重18～22g的雄性昆明种小鼠，于实验前将小鼠放在55±0.5℃的热板上测痛阈值，以小鼠舔后足为痛阈出现指标。凡痛阈值超过30s或低于5s的小鼠淘汰。用此法选出痛阈值在5s～30s之间的小鼠80只，随机分为8组，分组与给药方式同2.1.1。将选出的小鼠按上述方法重复测定其痛阈值。将每只小鼠所测两次痛阈值平均后，作为其给药前的痛阈值。每日给药1次，连续3d，测定末次给药后30 min，60 min，90 min的痛阈值，若小鼠在热板上60s内仍无痛觉反应，立即取出按60s计，比较各组间痛阈值差异。

2.2.2 对小鼠扭体反应的影响：取体重18～22g的雌性昆明种小鼠，随机分为8组，分组与给药方式同2.1.1，每日1次，连续给药3d，末次给药后30min，各鼠腹腔注射0.6%的醋酸溶液0.2ml，观察小鼠的痛阈及扭体出现的时间，以腹部收缩内凹、躯体扭曲、后肢伸展、臂部高举为指标，记录15 min内各组的扭体次数，并按下式计算各组的抑制率。

2.3 统计学处理各组数据以±S表示，用t检验测验其组间差异。

3 结果

3.1 抗炎作用

3.1.1 对二甲苯致小鼠耳廓炎症的影响：“四大血”水、醇提取物高、中剂量组，对二甲苯诱发的小鼠耳廓肿胀具有明显的抑制作用，与生理盐水组比较具有显著差异(P＜0.05;P＜0.01)，其作用与TSJN相当，而作用强度与给药剂量呈现一定的相关性。结果见表1。

表1 “四大血”对小鼠二甲苯耳廓肿胀的影响(±s，n=10)

表1 “四大血”对小鼠二甲苯耳廓肿胀的影响(±s，n=10)

注：①与生理盐水组比较*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01。

生理盐水 — 16.0±1.63 28.75——水 提 物 4.0 11.6±2.07＊＊ 27.50 2.0 11.9 ±1.77＊＊ 25.63 1.0 14.6 ±2.38 8.75醇 提 物 0.3 11.7±2.04＊＊ 26.88 0.2 11.5 ±2.51* 28.13 0.1 13.8 ±1.51 13.75 TSJN 0.4 11.4 ±2.15＊＊

3.1.2 对小鼠棉球肉芽肿增生的影响：“四大血”水、醇提取物各组的肉芽重量和肉芽指数均有所降低，与生理盐水组比较具有显著性意义(P＜0.05;P＜0.01)，而作用强度与给药剂量呈现一定的相关性。其中醇提物高剂量组的作用明显高于TSJN组(P＜0.05)。提示“四大血”醇与水提取物对小鼠棉球肉芽组织增生的慢性炎症有明显的抑制作用，其作用与剂量呈正相关。结果见表2。

表2 小鼠棉球肉芽肿实验(±s，n=10)

表2 小鼠棉球肉芽肿实验(±s，n=10)

生理盐水 — 30.60±2.006 12.81±1.289—20.92水 提 物 4.0 23.00±1.732＊＊ 8.81±1.035＊＊ 24.84 3.0 25.15 ±3.172＊＊ 10.00 ±1.409＊＊ 17.81 2.0 29.30 ±3.157* 11.06 ±2.022* 4.25醇 提 物 0.3 21.55±1.800＊＊△ 8.44±1.722＊＊△ 29.60 0.2 23.60 ±2.054＊＊ 7.34 ±1.189＊＊ 22.90 0.1 28.10 ±3.053* 10.63 ±1.944* 8.20 TSJN 0.4 24.20 ±3.276＊＊ 9.28 ±1.154＊＊

注：①与生理盐水组比较*P＜0.05;＊＊P＜0.01。②与TSJN 比较△P＜0.05。

3.1.3 对小鼠毛细血管通透性的影响：“四大血”水提物和醇提物对醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增加均有抑制作用，其中水与醇提物的高、中剂量组与生理盐水

表3 四大血”对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响(±s，n=10)

表3 四大血”对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响(±s，n=10)

注：①与生理盐水组比较*P＜0.05;＊＊P＜0.01②与TSJN比较△△P ＜0.01。

生理盐水 —0.60 ±0.062水 提 物 4.0 0.48 ±0.071＊＊2.0 0.51 ±0.071＊＊1.0 0.57 ±0.065醇 提 物 0.3 0.38 ±0.047＊＊△△0.2 0.53 ±0.060*0.1 0.55 ±0.075 TSJN 0.4 0.51 ±0.044＊＊

组相比均有显著性差异(P＜0.01)，且醇提物高剂量组作用明显高于TSJN组(P＜0.01)。提示“四大血”的水、醇提取物能拮抗醋酸引起的血管通透性增加，尤以醇提物高剂量组作用最强。结果见表3。

3.2 镇痛作用

3.2.1 对小鼠痛阈(热板法)的影响：“四大血”水、醇提物组的各剂量组药后60 min痛阈值均有不同程度的提高，其痛阈值的变化与剂量呈现一定的相关性。其中水提取物的中、低剂量组给药60与90 min后与生理盐水组比较具有显著性意义(P＜0.05;P＜0.01)。而醇提物高、中、低剂量组的痛阈值均有提示“四大血”对热板所致的非特异性疼痛具有一定抑制作用。结果见表4。

表4 －1“四大血”对小鼠痛阈(热板法)的影响(±s，n=10)

表4 －1“四大血”对小鼠痛阈(热板法)的影响(±s，n=10)

注：①与生理盐水组比较*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01②与 TSJN比较△P ＜0.05;△△P ＜0.01。

生理盐水 — 13.75±1.70 13.83±3.802 13.28±2.824 14.50±3.588 15.12 ±2.973水 提 物 4.0 14.11 ±2.421 15.99 ±2.513 17.18 ±2.834* 17.76 ±3.625 17.54 ±4.347 2.0 13.31 ±3.71 17.05 ±5.794 23.29 ±3.761＊＊△△ 19.77 ±3.628＊＊ 19.60 ±2.067＊＊△△1.0 13.55 ±2.625 16.32 ±2.343 21.59 ±4.173＊＊△ 19.84 ±3.455＊＊ 18.3 ±1.997*醇 提 物 0.3 14.32 ±2.294 15.87 ±2.566 20.2 ±2.401＊＊ 16.99 ±1.905 15.09 ±4.207 0.2 12.38 ±1.947 16.06 ±3.802 19.24 ±5.527＊＊ 20.11 ±3.967＊＊ 17.95 ±3.502 0.1 13.48 ±2.159 14.87 ±2.467 18.66 ±3.629＊＊ 18.61 ±3.313* 18.55 ±4.085*TSJN 0.4 13.43 ±2.085 14.78 ±2.96 18.57 ±1.777＊＊ 18.86 ±2.468＊＊16.94 ±2.547

表4 －2“四大血”对小鼠痛阈(热板法)的影响(±s，n=10)

表4 －2“四大血”对小鼠痛阈(热板法)的影响(±s，n=10)

TSJN 0.4 13.32 21.75 25.87 24.31水提物 4 29.73 55.41 62.44 44.99 2 10.31 38.42 38.06 37.61 1 10.05 38.27 40.43 26.14醇提物 0.3 27.76 74.98 48.01 47.26 0.2 20.44 59.34 46.21 35.06 0.1 10.82 41.06 18.65 5.38

3.2.2 对小鼠扭体反应的影响：“四大血”水提物高、中剂量组和醇提物各组对醋酸小鼠扭体次数均少于生理盐水组，统计学上存在明显差异，且抑制作用与剂量呈正相关性。但出现扭体的时间未见明显差异。结果见表5。

表5 “四大血”对小鼠扭体反应的影响(±s，n=10)

表5 “四大血”对小鼠扭体反应的影响(±s，n=10)

注：与生理盐水组比较*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01

生理盐水264.3 ±49.63 29.8 ±2.57水提物 4 226.2±25.24 18.7±5.48＊＊ 37.25 2 251.8 ±54.33 19.1 ±4.98＊＊ 35.91 1 257.1 ±57.50 24.7 ±5.29* 17.11醇提物 0.3 247.1±21.85 21.3 ±3.23＊＊ 28.52 0.2 224.8 ±42.71 24.6 ±6.50* 17.45 0.1 244.5 ±40.71 23.8 ±8.50* 20.13 TSJN 0.4 284.1 ±51.18 16.7 ±6.20＊＊43.00

4 讨论

风湿性疾病、跌打损伤、血瘀月经不调等疾病多有疼痛或炎症表现，本课题在整体动物模型上，从抗炎、镇痛等方面评价”四大血”的药理作用。抗炎实验显示，“四大血”水、醇提取物高、中剂量组对二甲苯致小鼠耳廓肿胀、小鼠棉球肉芽肿均有明显抑制作用，并能显著降低小白鼠腹腔毛细血管通透性。提示“四大血”对急慢性炎症有抑制作用。镇痛实验发现，“四大血”水、醇提取物各剂量组对乙酸腹腔注射引起的大面积深部疼痛和热板所致的非特异性疼痛，均显示有较好的抑制作用。腹腔注射乙酸所产生的疼痛为外周神经性疼痛，热剌激引起的疼痛主要为中枢性疼痛。提示“四大血”水、醇提取物对中枢及外周神经性疼痛均具有一定的抑制作用。由此证实了苗族应用“四大血”治疗多种炎症及疼痛类疾病的抗炎和镇痛疗效。其组方特点及其配伍规律，还有待进一步研究。

［1］曾定伦，熊传榘，等.苗药方”四大血”形性特征与适应症范围［J］.中国民族医药杂志，2004，10(增刊)：153～154

［2］王志文，张爱国等.麝香乌龙丸抗炎及镇痛药理研究［J］.时珍国医国药，2007，18(3);584

［3］陈奇.中药药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1993：356

［4］陈奇.中药药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2006：300～368