黄芩含药血清对脂多糖刺激大鼠原代小胶质细胞的保护作用

崔晓燕，张敏，杜增辉，韩文华

(河北省食品药品检验院，河北石家庄050011)

黄芩含药血清对脂多糖刺激大鼠原代小胶质细胞的保护作用

崔晓燕，张敏，杜增辉，韩文华

(河北省食品药品检验院，河北石家庄050011)

目的探讨黄芩提取物(SBE)含药血清对细菌脂多糖(LPS)引起的大鼠原代小胶质细胞活化的抑制作用。方法大鼠ig给予SBE 25 g·kg－1，给药后0.5～6 h眼底静脉丛取血，制备SBE含药血清。将SBE含药血清(终浓度10%)和LPS(终浓度1 mg·L－1)与大鼠原代小胶质细胞共培养24 h。采用MTT法测定细胞存活率;Griess还原法测定细胞培养液中一氧化氮(NO)含量;用超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒测定SOD活性;分别用微量丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量测定试剂盒测定MDA和GSH含量。结果在不影响细胞存活率的情况下，不同时间点的SEB含药血清可以显著降低LPS刺激的大鼠原代小胶质细胞培养液中NO和MDA的含量，SEB 0.5，1和2 h的含药血清使NO由LPS对照组的(14.2±0.8)μmol·L－1分别降低至12.9±0.6，9.2±0.6和(9.9±0.4)μmol·L－1(P＜0.05);SEB 1，2和3 h的含药血清使MDA由LPS对照组的(13.4±0.7)μmol·L－1分别降低至9.42±0.64，9.13±0.57和(11.78±0.71)μmol·L－1(P＜0.05);SBE 1和2 h含药血清可以显著增强培养液中SOD活性，分别由LPS对照组的(2.53±0.13)kU·L－1升高至3.52±0.18和(3.74±0.19)kU·L－1(P＜0.05);SBE 1和2 h含药血清可以显著升高培养液中GSH含量，分别由LPS对照组的(7.1±1.1)mg·L－1升高至8.6±1.6和(9.2±1.7)mg·L－1(P＜0.05)。结论SBE含药血清对LPS刺激的大鼠原代小胶质细胞活化具有一定的抑制作用。

黄芩提取物;细菌脂多糖;一氧化氮;丙二醛;超氧化物歧化酶;谷胱甘肽

黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)系唇形科植物黄芩的干燥根，主要产地为河北、河南、山东、陕西和吉林等地，具有清热燥湿、泻火解毒、抑菌、抗炎、止血、安胎和镇静等作用［1］。本课题组前期研究表明，黄芩含药血清可以抑制细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起的小鼠小胶质细胞系(N9细胞)的活化［2］，而且此含药血清对硝普钠(sodium nitroprusside)引起的大鼠大脑皮质神经元刺激也具有一定的保护作用［3］。目前，对黄芩的化学成分及主要药理作用已有较多报道，但关于其含药血清对神经系统的作用尚未见报道。小胶质细胞是中枢神经系统的免疫活性细胞，在中枢神经系统的免疫调节过程中发挥核心作用，可被多种物质激活［4］。小胶质细胞的激活在阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)发病中具有重要意义，AD的主要病理特征为皮质神经元纤维缠结和神经炎性斑的出现及氧化应激引起的大量神经元的死亡，这些都与小胶质细胞的活化有着密切关系［5－6］。LPS是一种较强的小胶质细胞刺激剂，体外或体内给予LPS均可导致小胶质细胞的激活，使其释放前炎症细胞因子和氧化自由基，并导致周围神经元损伤［7－8］。因此，用LPS激活小胶质细胞可以模拟AD患者脑内小胶质细胞的状态，用以评价药物对AD可能的防治作用［9－12］。本研究ig给予大鼠黄芩提取物(extract of S.baicalensis Georgi，SBE)，给药后不同时间制备SBE含药血清，观察SBE含药血清对LPS刺激的大鼠原代小胶质细胞培养液中一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的影响，以期了解黄芩是否能通过抑制小胶质细胞异常激活发挥对神经系统的保护作用。

1 材料与方法

1.1 药物

黄芩产自河北围场，由河北省食品药品检验院中药室鉴定。取黄芩净药材，10倍量水煎煮两次，浓缩至生药量15倍量体积，浓缩液于80℃调pH 1.5～2.0，保温1 h，静置，离心，沉淀用乙醇研磨均匀，离心，水洗至pH 5～6，干燥即得，黄芩提取率为10.6%。

1.2 动物、试剂和仪器

健康成年Wistar雄性大鼠，体质量250～280 g，河北省实验动物中心提供，合格证号码:006160，在自由摄食、饮水环境中适应3～4 d后用于实验。IMDM高糖干粉培养基，美国Gibco-BRL公司;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，天津TBD生物发展有限公司;胰蛋白酶，北京经科公司;LPS(E.coli O26∶B6)和MTT，美国Sigma公司;微量MDA含量试剂盒、GSH含量和SOD活性测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。CO2恒温培养箱，美国NUAIRE;VS-1300L-U型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;XDS-1B倒置生物显微镜，重庆光电仪器总公司;LDZ5-2自动平衡离心机，北京医用离心机厂;酶标仪，奥地利TECAN;重蒸水器，天津泰斯公司;恒温水浴器，北京长风集团公司。

1.3 黄芩含药血清的制备［13］

按前期整体动物实验所得到的SBE最低有效抗炎抗氧化剂量2.5 g·kg－1［14］计算本研究给药剂量，参考公式为:给药剂量=最低有效剂量×培养基内血清稀释度［15］(细胞培养基内血清稀释度为10倍)，计算得出本研究给药剂量为25 g·kg－1。取大鼠6只，给药前眼底静脉丛取血制备血清，为0 h血清(正常对照组血清)，然后按10 ml·kg－1ig给药，2 h后再给药1次，分别于末次给药后0.5，1，2，3，4，5和6 h眼底静脉丛取血，每只0.3 ml。室温放置1 h，离心，无菌分离并混合血清，56℃水浴中灭活30 min，－20℃冰箱冻存备用。

1.4 大鼠原代小胶质细胞培养［16］

将取得的大鼠皮质神经元密度调整为(3～5)×109L－1，按每瓶5～10 m1种植于75 cm2带螺口帽细胞培养瓶中，培养基成分:IMDM培养液，10%FBS，补加抗生素(青霉素100 U·L－1，链霉素100 mg·L－1);松盖静置培养于CO2培养箱(37℃，5%CO2)中，48 h后用等量培养基换液1次以去除死亡细胞碎片;以后间隔3～4 d换液1次，培养至11～14 d，收集细胞;将收集得到的细胞悬液转移重新种植于75 ml细胞培养瓶内，此时所得细胞成分即绝大部分为小胶质细胞。

继续培养24 h后，测定培养液中NO，MDA和GSH含量及SOD的活性。每样品设3个平行孔。

1.5 细胞存活率检测

用MTT法［17］测定细胞存活率。以含10%FBS的IMDM培养液调整细胞密度为3×108L－1，接种于96孔板内，每孔100 μl，于37℃，5%CO2的培养箱内培养。细胞贴壁培养12 h后，换成无血清的新鲜培养液，稳定2 h后加入LPS(终浓度1 mg·L－1)和各个时间点的SBE含药血清，另设LPS模型组(不加大鼠血清)和空白对照组(加入0 h SBE含药血清)，每孔10 μl。继续孵育24 h后加入0.25 g·L－1MTT，每孔10 μl，于37℃下共孵育4 h，吸除培养液后加入等体积的DMSO，室温振荡10 min，490 nm测定其吸光度(A)值。细胞存活率(%)=A实验组/A空白对照组×100%。

1.6 细胞培养液中NO，MDA和GSH含量及SOD活性检测

细胞培养和分组同1.5。孵育24 h后采用Griess还原法［18］测定培养液中NO含量。MDA和GSH含量及SOD活性测定分别采用微量MDA和GSH含量试剂盒和SOD活性测定试剂盒进行。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 SBE含药血清对LPS刺激的大鼠原代小胶质细胞存活率的影响

表1结果显示，与正常对照组比较，LPS模型组及不同时间点SBE含药血清组大鼠原代小胶质细胞存活率无明显变化，表明本研究所用实验条件对细胞存活率无影响。为此，在该实验条件下探讨了SEB含药血清对LPS刺激的大鼠原代小胶质细胞的保护作用。

Tab.1 Effect of serum containing extract of S.baicalensis Georgi(SBE)on viability of rat primary microglia cells stimulated with lipopolysaccharide(LPS)

2.2 SBE含药血清对LPS刺激大鼠原代小胶质细胞培养液内NO，MDA和GSH含量及SOD活性的影响

如表2所示，与LPS模型组比较，SBE 0.5，1和2 h的含药血清可明显降低培养液中NO含量，其中1 h含药血清的作用最为明显;SBE 1，2和3 h的含药血清明显降低MDA含量，其中2 h含药血清的作用最为明显;SBE 1和2 h的含药血清明显升高SOD活性，其中2 h含药血清的作用最为明显;SBE 1和2 h的含药血清明显增加GSH含量，其中2 h含药血清的作用最为明显。

3 讨论

中药血清药理学是指将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液、分离血清，用此含有药物成分的血清进行体外实验的一种实验技术。黄芩是一种传统的中药，SBE中往往会含有多种成分，如果将SBE直接加入到细胞反应体系中，这些成分的一些理化性质会对实验结果产生干扰。本研究将SBE ig给予大鼠，然后在不同时间点制备SBE含药血清，研究SBE含药血清对大鼠原代小胶质细胞的影响。相对来说，这种方法更能反映黄芩整体的药理学作用［19］。

小胶质细胞是中枢神经系统的免疫活性细胞，当各种类型脑损伤及脑疾病发生时，小胶质细胞就会成为“活化的小胶质细胞”，同时感染区内细胞数量增多。活化的小胶质细胞可以释放多种神经毒性物质［20］，如NO、喹啉酸(可生成神经毒性物质，使大量组织发生脂质过氧化作用［21］)、活性氧物质、二十碳烯酸类物质(其细胞毒性作用表现为诱发O2－的释放及环氧合酶的活化［22］)和急性期蛋白等等。因此，一些可以用来抑制小胶质细胞激活的药物显示了对AD的预防及治疗作用。

本研究制备LPS诱导的大鼠原代小胶质细胞活化模型，模拟AD患者脑内小胶质细胞的状态，观察了SBE不同时间点的大鼠含药血清对LPS诱导的大鼠原代小胶质细胞培养液中NO，MDA和GSH含量及SOD活性的影响。实验结果表明，在不影响细胞存活率的情况下，SBE 0.5，1和2 h的含药血清可以显著降低LPS刺激的大鼠原代小胶质细胞培养液中NO的含量;SBE 1，2和3 h的含药血清可以显著降低LPS刺激的大鼠原代小胶质细胞培养液中MDA的含量;SBE 1和2 h的含药血清可以显著升高LPS刺激的大鼠原代小胶质细胞培养液中SOD的活性;SBE 1和2 h的含药血清可以显著升高LPS刺激的大鼠原代小胶质细胞培养液中GSH的含量。上述实验结果从细胞水平上证明SBE对LPS刺激引起的大鼠原代小胶质细胞的活化具有一定的抑制作用。

实验结果也表明，SBE经大鼠体内代谢0.5～6 h时存在不同程度的药理作用。SBE在体内代谢0.5 h时可发挥药理作用;1～2 h时活性较强;4 h后药理活性基本消失。提示黄芩及其代谢物在体内发挥药理作用具有一定的时效关系。

Tab.2 Effect of serum containing SBE on nitric oxide(NO)，malondialdehyde(MDA)，glutathione(GSH)contents and superoxide dismutase( SOD)activity in medium of rat primary microglia cells stimulated with LPS

本实验室前期研究表明，SBE含药血清对硝普钠引起大鼠大脑皮质神经元刺激有一定的抑制作用，不同时间点SBE的含药血清在不影响细胞存活率的情况下，可不同程度地降低硝普钠刺激后大鼠大脑皮质神经元NO和MDA含量，并不同程度地增加SOD活性［3］。本研究结果与该研究报道基本一致，为把黄芩开发为预防和治疗AD的有效药物提供了实验依据。

［1］Gao Z，Huang K，Yang X，Xu H.Free radical scavenging and antioxidant activities of flavonoids extracted from the radix of Scutellaria baicalensis Georgi［J］.Biochim Biophys Acta，1999，1472(3):643-650.

［2］Cui XY，Zhang M，Liu XM.Anti-inflammatory and immunity effect of Scutellaria baicalensis Georgi in serum on three macrophages［J］.Chin J Clin Pharmacol(中国临床药理学杂志)，2011，27(4):287-290.

［3］Cui XY，Zhang M，Liu XL.Protective effects of Scutellaria baicalensis Georgi in serum on the sodium nitroprusside-stimulated rat cortical neurons［J］.Chin J Clin Pharmacol(中国临床药理学杂志)，2011，27(3):202-205.

［4］Banati RB，Gehrmann J，Schubert P，Kreutzberg GW.Cytotoxicity of microglia［J］.Glia，1993，7(1):111-118.

［5］Dickson DW.The pathogenesis of senile plaques［J］.J Neuropathol Exp Neurol，1997，56(4):321-339.

［6］Wisniewski T，Ghiso J，Frangione B.Biology of A beta amyloid in Alzheimer's disease［J］.Neurobiol Dis，1997，4(5):313-328.

［7］Swantek JL，Cobb MH，Geppert TD.Jun N-terminal kinase/stress－activated protein kinase(JNK/SAPK)is required for lipopolysaccharide stimulation of tumor necrosis factor alpha(TNF-alpha)translation:glucocorticoids inhibit TNF-alpha translation by blocking JNK/SAPK［J］.Mol Cell Biol，1997，17(11):6274-6282.

［8］Jiang Y，Liu AH，Huang QB.p38 MAPK signal is necessary for TNF-alpha gene expression in RAW cells［J］.Acta Biochem Biophys Sin(生物化学与生物物理学报)，1999，31(1):9-15.

［9］González-Scarano F，Baltuch G.Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases［J］.Annu Rev Neurosci，1999，22:219-240.

［10］Stoll G，Jander S.The role of microglia and macrophages in the pathophysiology of the CNS［J］.Prog Neurobiol，1999，58(3):233-247.

［11］Lee YB，Nagai A，Kim SU.Cytokines，chemokines，and cytokine receptors in human microglia［J］.J Neurosci Res，2002，69(1):94-103.

［12］McGeer EG，McGeer PL.Inflammatory processes in Alzheimer's disease［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2003，27(5):741-749.

［13］Bochu W，Liancai Z，Qi C.Primary study on the application of serum pharmacology in Chinese traditional medicine［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2005，43(3-4):194-197.

［14］Yang L，Cui XY，Zhang X.Antiinflammatory and immunomodulation effects of the extract of Scutellaria baicalensis Georgi［J］.China Pharm(中国药房)，2007，18(24):1856-1858.

［15］Yang YF，Wang YQ.Standardization of compound Chinese medicine serum pharmacology method［J］.Chin J Integrated Tradit Chin West Med(中国中西医结合杂志)，2002，5(4):380-382.

［16］Giulian D，Baker TJ.Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain［J］.J Neurosci，1986，6(8):2163-2178.

［17］Chang JY，Chavis JA，Liu LZ，Drew PD.Cholesterol oxides induce programmed cell death in microglial cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，249(3):817-821.

［18］Barger SW，Harmon AD.Microglial activation by Alzheimer amyloid precursor protein and modulation by apolipoprotein E［J］.Nature，1997，388(6645):878-881.

［19］Zhang L，Xu L，Yuan DP，Fang TH.Research progress of traditional Chinese medicine serum pharmacology method［J］.J Nanjing Univ Tradit Chin Med〔南京中医药大学学报(自然科学报)〕，2002，7(18):254-256.

［20］Yan SD，Chen X，Fu J，Chen M，Zhu H，Roher A，et al.RAGE and amyloid-beta peptide neurotoxicity in Alzheimer's disease［J］.Nature，1996，382(6593):685-691.

［21］Ernfors P，Lee KF，Jaenisch R.Mice lacking brain-derived neurotrophic factor develop with sensory deficits［J］.Nature，1994，368(6467):147-150.

［22］Bate C，Rutherford S，Gravenor M，Reid S，Williams A.Cyclo-oxygenase inhibitors protect against prion-induced neurotoxicity in vitro［J］.Neuroreport，2002，13(15):1933-1938.

Inhibitory effect of serum containing Scutellaria baicalensis Georgi on activity of rat primary microglia cells stimulated by lipopolysaccharide

CUI Xiao-yan，ZHANG Min，DU Zeng-hui，HAN Wen-hua
(Hebei Provincial Institute for Food and Drug Control，Shijiazhuang050011，China)

OBJECTIVETo investigate the protective effect of serum containing extract of Scutellaria baicalensis Georgi(SBE)on the lipopolysaccharide-stimulated activity of primary microglia cells of rats.METHODSThe rats were ig given SBE 25 g·kg－1and blood was taken from retinal venous plexuses within 0.5－6 h and the serum containing SBE was prepared.Then the primary microglia cells from normal rats were incubated with serum containing SBE(10%)and LPS(final concentration 1 mg·L－1)for 24 h.The content of nitric oxide(NO)，malondialdehyde(MDA)，superoxide dismutase(SOD)and glutathione(GSH)in the supernatant was examined with corresponding kits.RESULTSSerum containing SBE markedly decreased the content of NO and MDA in the LPS-stimulated primary rat microglia cells without affecting cell survival.NO content of the LPS model group was(14.2±0.8)μmol·L－1;serum containing SBE within 0.5，1 and 2 h reduced NO content to 12.9±0.6，9.2±0.6 and(9.9±0.4)μmol·L－1(P＜0.05).MDA content of the LPS model group was(13.4±0.7)μmol·L－1;serum containing SBE within 1，2 and 3 h decreased MDA content to 9.4±0.6，9.1±0.6 and(11.8±0.7)μmol·L－1(P＜0.05).Also，serum containing SBE remarkably increased the content of SOD and GSH in the LPS-stimulated primary rat microglia cells without affecting cell survival.SOD activity of the LPS model group was(2.53±0.13)kU·L－1;serum containing SBE within 1 and 2 h increased SOD activity to 3.52±0.18 and(3.74±0.19)kU·L－1(P＜0.05).GSH content of the LPS model group was(7.1±1.1)mg·L－1;serum containing SBE within 1 and 2 h increased GSH content to 8.6±1.6 and(9.2±1.7)g·L－1.CONCLUSIONSerum containing SBE can inhibit the activity of rat primary microglia cells stimulated by lipopolysaccharide.

Scutellaria baicalensis Georgi;lipopolysaccharides;nitric oxide;malondialdehyde;superoxide dismutase;glutathione

CUI Xiao-yan，E-mail:cuijin72696@163.com，Tel:(0311)85212004-8047

R285.5

A

1000-3002(2012)04-0494-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.005

崔晓燕(1979－)，沈阳药科大学药理系硕士研究生，主管药师，主要从事中药神经药理学研究。

联系作者:崔晓燕，E-mail:cuijin72696@163.com，Tel:(0311)85212004-8047

2011-12-12接受日期:2012-07-17)

(本文编辑:齐春会)