黄芪提取物与红花总黄酮配伍对急性血瘀大鼠血液流变学的改善作用

马旭，张可，韩淑燕，3，马治中，屠鹏飞

(1.北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京100191;2.国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心，北京100083;3.北京大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京100142)

黄芪提取物与红花总黄酮配伍对急性血瘀大鼠血液流变学的改善作用

马旭1，2，张可1，韩淑燕1，3，马治中1，屠鹏飞1

(1.北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京100191;2.国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心，北京100083;3.北京大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京100142)

目的观察黄芪提取物(EAM)与红花总黄酮(ECT)配伍对急性血瘀模型大鼠血液流变学指标的影响。方法大鼠随机分为正常对照、急性血瘀模型、阳性对照阿司匹林100 mg·kg－1，EAM 400 mg·kg－1，ECT 200 mg·kg－1，EAM 400 mg·kg－1+ECT 200 mg·kg－1组。每天早晚各给药1次，共7次。第5次给药后，大鼠sc给予肾上腺素加冰浴制备急性血瘀模型。锥板法测定全血黏度和血浆黏度;微量毛细管法测定血细胞比容(Hct);光电比浊法测定二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集;光电电磁法测定凝血参数。结果与正常对照组相比，模型组大鼠全血黏度和血浆黏度升高，红细胞聚集指数和血小板最大聚集率显著增加，Hct显著升高，纤维蛋白原(Fib)含量显著增加，凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)均显著缩短(P＜0.01)。与模型组相比，单独应用EAM和ECT均能显著降低全血黏度及血浆黏度，明显降低Hct、红细胞聚集指数和血小板最大聚集率，其中EAM还能显著降低Fib含量，延长APTT和TT;ECT还能显著延长PT。与单独应用EAM或ECT相比，EAM与ECT配伍能进一步改善血液流变学指标，在延长TT上优于单用ECT(P＜0.05)，对血小板最大聚集率的抑制作用优于单用EAM或ECT(P＜0.05)。与阿司匹林相比，单用EAM或ECT抑制血小板聚集的作用不及阿司匹林，但EAM降低Fib的作用较好，ECT延长PT的作用较好;EAM与ECT配伍对血液流变学的改善作用与阿司匹林相似。结论EAM和ECT单用能显著改善血瘀模型大鼠血液流变学指数，且二者配伍后能增强对血瘀模型大鼠血液流变学的改善作用。

黄芪提取物;红花总黄酮;血液流变学;血瘀;血小板聚集;全血凝固时间;纤维蛋白原

冠心病属中医“胸痹”范畴，其病机为气虚血瘀。“气血理论”是中医学体系的重要理论基础，对临床辨证施治、选方用药和判断预后等均有重要的指导意义。冠心病与血液流变学关系密切，从血液流变学角度研究中医药的作用机制，可促进中医药在冠心病治疗方面的应用。

补气中药黄芪具有抑制血小板聚集、防止血栓形成、降低全血和血浆黏度、增加冠脉血流量等作用。活血中药红花及其制剂对二磷酸腺苷(adenosinediphosphate，ADP)诱导的血小板聚集具有抑制作用，能增加大鼠血液纤维蛋白酶溶解活性，对大鼠体外血栓形成有抑制作用［1］。黄芪总皂苷和总黄酮是黄芪发挥药效的主要活性成分，红花中主要含有黄酮类化合物，均具有改善血液流变异常的作用［2－5］。本研究将以总皂苷和总黄酮为有效部位的黄芪提取物(extract of Astragalus membranaceus，EAM)与红花总黄酮(extract of Carthamus tinctorius，ECT)配伍，探讨益气活血中药及其配伍对血液流变学指标的改善作用。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂

黄芪为豆科植物蒙古黄芪〔A.membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao〕或膜荚黄芪〔A.membranaceus(Fisch.)Bge.〕的干燥根。本研究所用黄芪药材来源于山西省浑源县，经北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室屠鹏飞教授鉴定为蒙古黄芪，样品保存在北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室。EAM的制备工艺为:黄芪饮片加8倍体积去离子水浸泡1 h，加热煎煮提取3 h，滤过，滤液备用;药渣再加6倍体积去离子水，煎煮提取2次，每次2 h，滤过。合并3次滤液，减压浓缩至相对密度1.15～1.20(50℃)，冷却至室温，加95%乙醇至含醇量达80%，放置12 h。倾出上清液，沉淀离心，备用。合并上清液和滤液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃);浓缩液加0.5倍体积水稀释，滤过，滤液徐徐注入已处理好的HPD-600大孔吸附树脂柱内，先用去离子水洗至近无色(检测还原糖反应阴性，用水量约为药材量的10倍)，弃去水液;再用2倍柱体积量的20%乙醇洗脱，弃去20%乙醇洗脱液;再用4倍量的70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度1.15～1.25(50℃)，真空干燥(60℃)，粉碎，即得EAM，收率为1.0%。EAM中含有黄芪甲苷13.61%，黄芪皂苷Ⅲ0.97%，黄芪皂苷Ⅱ3.71%，黄芪皂苷Ⅰ0.8%，毛蕊异黄酮苷6.08%，芒柄花素3.95%。

红花为菊科植物红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花。红花药材来源于河北省安国市，经北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室屠鹏飞教授鉴定为红花，样品保存在北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室。ECT为本实验室自制［6］，含羟基红花黄色素A 12.20%，山奈酚-3-O-芸香糖苷0.71%。

阿司匹林肠溶片，拜耳医药保健有限公司，批号:BTA6E93;盐酸肾上腺素10 mg·L－1注射液，天津市氨基酸公司，批号:20070612;凝血酶时间(thrombin time，TT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin，APTT)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)和纤维蛋白原(fibrinogen，Fib)检测试剂，均购自北京中勤世帝科学仪器公司;ADP，中国科学院上海生物化学研究所。

1.2 主要仪器

LG-R-80B型血液黏度仪和血小板聚集凝血因子分析仪，北京中勤世帝科学仪器有限公司;LBY-BX2红细胞变形仪，北京普利生仪器有限公司;TGL-16G A冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂;3F-2型多功能微量高速离心机，中国人民解放军第四军医大学暨航空工业部华兴航空机轮公司。

1.3 动物及急性血瘀模型制备［7］

Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，体质量240～280 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，动物合格证号:SCXK(京)2002-0001。大鼠sc给予肾上腺素0.8 mg·kg－1共2次，间隔时间为4 h。第1次sc给予肾上腺素0.8 mg·kg－1后2 h，将大鼠置于0℃冰水中游泳5 min，2 h后再第2次sc给予肾上腺素0.8 mg·kg－1，造成大鼠急性血瘀症。

1.4 动物分组及给药

将大鼠随机分为6组，每组10只，即正常对照、急性血瘀模型、阳性对照阿司匹林100 mg·kg－1、EAM 400 mg·kg－1、ECT 200 mg·kg－1和EAM 400 mg·kg－1+ECT 200 mg·kg－1组。各给药组大鼠ig给药，正常对照组和模型组大鼠ig给予等体积的生理盐水，每日早晚各1次，共7次。于第5次给药后，除对照组sc给予生理盐水外，其余各组大鼠制备大鼠急性血瘀症模型后，禁食16～18 h，期间给第6次和第7次药。最后一次给药后30 min腹主动脉取血，肝素钠20 kU·L－1抗凝，用于全血黏度、血浆黏度和血细胞比容(hematocrit，Hct)的测定，3.8%枸橼酸钠抗凝血(枸橼酸钠∶全血为1∶9，V/V)用于APTT，TT，PT和Fib及血小板聚集的测定。

1.5 全血黏度和血浆黏度的测定

以锥板式旋转黏度计测定大鼠全血黏度。取肝素抗凝的0.8 ml全血加入血液黏度计的样品池中，于37℃测定切变率200，100，50和1 s－1下的全血黏度，并计算红细胞聚集指数(erythrocyte aggregation index，EAI)［8］，即EAI=ηa1/ηa100，其中ηa1是切变率1 s－1下的全血黏度，ηa100是切变率100 s－1下的全血黏度。取2 ml肝素抗凝血，3000×g离心15 min，取0.8 ml血浆于37℃测定血浆黏度。

1.6 血细胞比容的测定

取肝素钠抗凝血适量，10 000×g离心5 min，以微量毛细管法测定Hct。

1.7 比浊法测定血小板聚集性

取枸橼酸钠抗凝血2 ml，800×g离心10 min，制备富血小板血浆;再以2500×g离心10 min，制备贫血小板血浆，调节血小板密度约2.5×1011L－1，以终浓度5 μmol·L－1的ADP为血小板聚集诱导剂，采用比浊法于37℃测定血小板最大聚集率。

1.8 APTT，TT，PT和Fib含量的测定

取枸橼酸钠抗凝血1 ml，3000×g离心15 min，取上层血浆，采用血小板聚集凝血因子分析仪，按测定试剂说明方法于37℃测定APTT，TT，PT和Fib含量。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 黄芪提取物和红花总黄酮对急性血瘀大鼠全血黏度和血浆黏度的影响

表1显示，与正常对照组相比，模型组大鼠切变率在200，100，50和1 s－1下的全血黏度及血浆黏度明显增高(P＜0.01)。与模型组相比，切变率在200，100，50和1 s－1时，EAM 400 mg·kg－1和ECT 200 mg·kg－1单独使用均可显著降低全血黏度及血浆黏度;EAM与ECT配伍组与单味药组相比无明显差异(P＞0.05)。

2.2 黄芪提取物和红花总黄酮对急性血瘀大鼠血细胞比容和红细胞聚集的影响

表2显示，与正常对照组相比，模型组大鼠的Hct和EAI明显增加(P＜0.01)。与模型组相比，单独使用EAM 400 mg·kg－1和ECT 200 mg·kg－1均可明显降低Hct(P＜0.05)和EAI(P＜0.05)。与单用EAM和ECT相比，EAM与ECT配伍组能进一步降低Hct(P＜0.05)和EAI(P＜0.01)，表明EAM和ECT配伍在降低Hct和EAI方面具有一定的协同作用。

2.3 黄芪提取物和红花总黄酮对二磷酸腺苷诱导血小板聚集的影响

表3显示，与正常对照组相比，血瘀模型组大鼠的血小板聚集率明显增加(P＜0.01)。与模型组相比，单独使用EAM 400 mg·kg－1或ECT 200 mg·kg－1

Tab.2 Effect of EAM and ECT alone or in combination on hematocrit(Hct)and erythrocyte aggregation index(EAI)in rats with blood stasis

均可显著降低血小板的聚集(P＜0.05)。与单用EAM和ECT相比，EAM与ECT配伍组能进一步降低血小板最大聚集率(P＜0.05)，提示配伍组在抑制ADP诱导的血小板聚集上具有协同增效作用。

Tab.3 Effect of EAM and ECT alone or in combination on platelet maximum rate in rats with blood stasis

Tab.1 Effect of extract of A.membranaceus(EAM)and extract of C.tinctorius(ECT)alone or in combination on whole blood and plasma viscosity in rats with blood stasis

2.4 黄芪提取物和红花总黄酮对凝血参数的影响

表4显示，与正常对照组相比，急性血瘀模型组的Fib含量升高，APTT，TT和PT显著缩短(P＜0.01)。与模型组相比，EAM 400 mg·kg－1能显著降低Fib含量，延长APTT和TT(P＜0.05);ECT 200 mg·kg－1能显著延长PT(P＜0.05)，但对Fib含量以及APTT和TT无明显影响。与单用EAM或ECT相比，EAM+ECT配伍组能进一步降低Fib，延长APTT，TT和PT，且在延长TT方面与ECT相比具有显著性差异(P＜0.05)。

3 讨论

心肌缺血时，冠状动脉的狭窄阻塞势必会影响血液流变学的改变。临床研究资料表明，心肌缺血患者存在不同程度血液流变学的异常，主要表现在Fib、血浆黏度、全血黏度和EAI升高，纤溶活性和红细胞变形下降，这些血流变异常对缺血心肌产生负面效应。

全血黏度反映血液流变性的总体变化，高切值反映红细胞的变形能力情况，低切值反映红细胞和血小板聚集能力的变化，血浆黏度反映血中可溶性成分的变化，其中Fib和红细胞聚集性是影响两者的主要原因。Fib分子是纤维状，容易弯曲，引起分子间牵连而使黏度增大。同时Fib通过桥联作用连接邻近红细胞，使之成为可逆性簇状的一堆聚集体，导致红细胞聚集性显著增高，原来不易聚集的部位，如微动脉或毛细血管近动脉段，也可出现红细胞聚集体。红细胞聚集性增高可堵塞血管，导致严重的微循环障碍。缺血缺氧状态下红细胞发生严重聚集会影响局部微循环畅通，使血流阻滞。因此，当红细胞膜的弹性减低，而刚性指标增高，红细胞变硬、变脆，造成组织灌注不良，缺氧和酸中毒，引起血小板聚集，这些结果又反过来加重血液黏度的增高，聚集性增高，造成恶性循环［9－10］。

黄芪作为补气要药，可降低血小板黏附率、抑制血小板聚集、降低Fib和Hct、防止血栓形成，从而降低全血和血浆黏度、增加冠脉血流量［11－12］。此外，活血中药红花及其制剂对ADP诱导的血小板聚集具有抑制作用，能增加大鼠血液纤维蛋白酶溶解活性，降低高、低切变率时的全血黏度、血浆黏度和红细胞的聚集性，抑制大鼠体外血栓形成，增强红细胞变形性等［13］。

中医理论认为“大怒致瘀”，“外寒也可致瘀”。本研究采用给予大鼠皮下注射大剂量肾上腺素模拟暴怒时的机体状态，并以冰水浸泡模拟寒邪入侵，在两种因素综合作用下复制大鼠急性血瘀证模型。肾上腺素为α和β受体激动剂，具有收缩外周血管和增加心肌收缩力的作用，使心脏负荷增加，心肌耗氧代谢增加，心功能下降，从而使血液运行障碍，血液黏度增加，加之液体的黏度在温度降低时升高，再给动物施以冰水冷浴。二者的综合作用使得模型组各项血液流变学指标均较正常组显著升高，复制出血液流变性呈“黏、浓、凝、集”的状态。

给予EAM，ECT及其复方配伍后血瘀大鼠的全血黏度、EAI及血小板聚集率降低，说明其可以通过抑制血细胞聚集而达到抑制血“聚”的作用。血浆黏度降低，表明其可能通过降低血浆中Fib等生物大分子物质的含量起到抑制血“浓”、“黏”的作用。APTT反映内源性凝血系统各凝血因子总的凝血状态，PT反映外源性凝血系统因子的凝血状况，TT反映Fib转变为纤维蛋白，至凝固所需的时间。EAM及EAM与ECT配伍组能使血瘀大鼠的APTT和TT显著升高，而Fib含量显著降低，且配伍组的作用优于EAM单味药组;ECT及EAM与ECT配伍组可使血瘀大鼠的PT显著升高，且配伍组的作用优于ECT单味药组，可见EAM，ECT及其配伍可通过对内、外源性凝血系统各因子的作用和降低血浆中Fib含量来延长凝血时间进而起到抑制血“凝”的作用。其中EAM在降低血浆Fib含量，延长凝血APTT和TT等方面的作用强于ECT;而ECT在降低红细胞指数、抑制血小板聚集率及延长凝血PT等方面则体现出了优势，且总体来讲EAM+ECT配伍组的作用优于单味药组。

Tab.4 Effect of EAM and ECT alone or in combination on fibrinogen(Fib)，activated partial thrombin time(APTT)，thrombin time(TT)and prothrombin time(PT)in rats with blood stasis

综上所述，EAM，ECT及其配伍具有一定的纠正血液流变性异常的作用，且配伍组的作用优于两个单味药组，进一步提示在改善血瘀大鼠的血液流变学方面黄芪和红花配伍可以补气活血，气血双补，兼二者之长，为临床上联合应用补气药和活血药进行心血管方面疾病的治疗提供了一定的实验依据。

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Ameliorative effect of extract of Astragalus membranaceus combined
with flavonoids of Carthamus tinctorius on hemorheology in rats with acute blood stasis

MA Xu1，2，ZHANG Ke1，HAN Shu-yan1，3，MA Zhi-zhong1，TU Peng-fei1
〔1.State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs，School of Pharmaceutical Sciences，Peking University，Beijing100191，China;2.Patent Examination Cooperation Center of SIPO，Beijing100083，China;3.Beijing Cancer Hospital＆Institute，School of Oncology，Peking University，Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research(Ministry of Education)，Beijing100142，China〕

OBJECTIVETo evaluate the effect of extract of Astragalus membranaceus(EAM)combined with extract(flavonoids)of Carthamus tinctorius(ECT)on the hemorheological abnormality in rats with acute blood stasis.METHODSThe rats were ig given EAM 400 mg·kg－1，ECT200 mg·kg－1，EAM400 mg·kg－1+ECT200 mg·kg－1andaspirin 100 mg·kg－1，twice a day，for seven consecutive times.After the 5th administration，the rats were given adrenaline and ice water soaking to set up the acute blood stasis model.Whole blood viscosity and plasma viscosity were evaluated by cone-plate viscometer，hematocrit(Hct)determined by micro-capillary method，platelet aggregation measured by photoelectric turbidimetry and coagulation parameters evaluated by optical electromagnetic method.RESULTSCompared with normal control group，the whole blood viscosity and plasma viscosity of rats significantly increased，erythrocyte aggregation index(EAI)and the maximum platelet aggregation rate were also remarkably elevated in blood stasis model group.Simultaneously，Hct and fibrinogen(Fib)contents were also increased while prothrombin time(PT)，activated partial thrombin time(APTT)and thrombin time(TT)were shortened(P＜0.01).Compared with model group，EAM 400 mg·kg－1or ECT 200 mg·kg－1alone could obviously decrease whole blood viscosity and plasma viscosity，reduce EAI and Hct，and inhibit the ADP-induced platelet maximum aggregation rate(P＜0.05，P＜0.01).Meanwhile，EAM 400 mg·kg－1significantly decreased Fib content but delayed the APTT and TT;ECT 200 mg·kg－1significantly delayed the PT.Compared with EAM or ECT group，EAM 400 mg·kg－1+ECT 200 mg·kg－1ameliorated abnormal hemorheology in rats with acute blood stasis，as revealed by the more delayed TT(P＜0.05)and greater platelet maximum aggregation inhibition(P＜0.05).Compared with aspirin group，EAM and ECT showed less inhibition of platelet aggregation while EAM had a little better effect on Fib content reduction，ECT could more effectively delay PT.EAM+ECT could improve hemorheology as much as aspirin.CONCLUSIONEAM 400 mg·kg－1+ECT 200 mg·kg－1improves abnormal hemorheology in rats with acute blood stasis more effectively in combination than used alone.

extract of Astragalus membranaceus;flavonoids of Carthamus tinctorius;hemorheology;blood stasis;platelet aggregation;whole blood coagulation time;fibrinogen

The project supported by National Science Fund for Distinguished Young Scholars(30525043)

TU Peng-fei，E-mail:pengfeitu@vip.163.com，Tel:(010)82802750

R973，R285

A

1000-3002(2012)04-0504-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.007

国家杰出青年基金资助课题(30525043)

马旭(1980－)，女，助理研究员，主要从事药物领域专利申请实质审查;屠鹏飞(1963－)，男，教授，博导，主要从事天然药物活性成分与新药研究。

屠鹏飞，E-mail:pengfeitu@vip.163.com，Tel:(010)82802750

2011-12-05接受日期:2012-04-26)

(本文编辑:齐春会)