线粒体在心肌缺血再灌注损伤中的作用研究进展

杨一萍，骆媛，范礼斌，王永安

(1.军事医学科学院毒物药物研究所军事毒理与生化药理研究室，北京100850;2.安徽医科大学生命科学院生物学教研室，安徽合肥230032)

线粒体在心肌缺血再灌注损伤中的作用研究进展

杨一萍1，2，骆媛1，范礼斌2，王永安1

(1.军事医学科学院毒物药物研究所军事毒理与生化药理研究室，北京100850;2.安徽医科大学生命科学院生物学教研室，安徽合肥230032)

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的关键环节之一是细胞能量供应缺乏。线粒体作为细胞的能量供应站，与缺血再灌注损伤机制的多个环节密切相关，其功能障碍造成缺血再灌注对心肌细胞的严重损害的同时又能启动保护机制减轻MIRI。目前对线粒体在MIRI中所起作用的研究已深入到分子水平，以线粒体上某些分子如线粒体通透性转换孔和敏感性钾通道等为靶点，探索治疗MIRI的新策略成为近来研究的热点。本文就线粒体与MIRI相关的分子机制和以线粒体为治疗靶点的药物研究等方面做一综述。

线粒体;心肌缺血再灌注损伤;治疗靶点

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是心肌缺血后在一定时间内恢复血供时缺血心肌发生一系列更严重的毒性反应，主要包括心律失常、心肌收缩功能障碍和再灌注性心肌不可逆损伤等。近年来，临床上冠脉搭桥术等治疗手段的广泛应用使伴随它们而来的再灌注损伤越来越受重视。关于再灌注损伤的机制目前有多种假说，主要有氧自由基大量产生、钙离子超载、内皮细胞和中性粒细胞激活的炎症反应以及以细胞凋亡为主的心肌不可逆损伤等，而启动这些环节的关键之一是心肌细胞的氧供障碍，ATP生成缺乏。线粒体是氧化磷酸化产生ATP的重要细胞器，它与MIRI的各个环节都有密切关系，包括心肌细胞凋亡等损伤环节和潜在的保护靶点等［1］。

1 线粒体与心肌缺血再灌注损伤

线粒体主要由内膜、外膜和膜间基质组成，其结构的多个组分，如内、外膜间的非特异性线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)，内膜上的电子传递链(electron transport chain，ETC)，线粒体钾离子通道和抗凋亡Bcl-2蛋白家族等均在MIRI中发挥了重要作用。

1.1 线粒体通透性转换孔与MIRI

MPTP作为线粒体内外膜之间信息交流的枢纽，其关闭和开放状态在MIRI时心肌细胞的死亡中扮演着至关重要的角色［2］。目前MPTP的结构尚未阐明，通常认为它是一个蛋白复合体，由外膜蛋白电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)、内膜蛋白腺嘌呤核苷酸易位子(adenine nucleotide translocator，ANT)以及基质中的环亲蛋白D(cyclophilin D，Cyp-D)组成，三者在膜接触位点相互作用［3］。VDAC家族包括3个亚型VDAC1～3［4］，它能促进ATP/ADP通过外膜有效地转运而被看成MPTP的关键组成部分。而Baines等［5］建立了缺乏3个VDAC亚型的线粒体细胞模型显示它们能经受MPTP开放造成的损害，说明VDAC的3个亚型之间有高度的同源性［4］。ANT有C和M两种构象，通过构象改变调节了ATP/ADP通过线粒体内膜的交换。人体内ANT有3个同源亚型ANT1～3，其中ANT1和Cyp-D作用在线粒体内外膜之间的接触点上，这个点被认为是孔道的坐落位置。ANT1的过表达有细胞毒作用，ANT1过表达在大鼠心肌病模型上却发挥心肌保护作用［5］，研究还发现ANT更可能是起外周调节蛋白作用，它能调节MPTP对腺嘌呤核酸的敏感性［6］。Cyp-D只有一个已知的基因(Ppif基因)，由于它能催化肽链上脯氨酸的旋光性，因此能在目的蛋白上诱导构象变化［7］，Cyp-D缺陷的线粒体和细胞能对抗钙离子、氧化应激诱发的MPTP开放和细胞死亡。

MPTP存在完全关闭状态、可逆性低水平/低通透性开放和不可逆性高水平/高通透性开放3种状态，它们与线粒体跨膜电位(△ψm)密切相关。再灌注后，pH值迅速恢复，酸中毒得以纠正，线粒体ATP生成增多，线粒体膜的电子转运能力逐渐恢复，在ANT的调节下，VDAC促使ATP/ADP有效地转运使△ψm不可逆降低;同时氧自由基和Ca2+超载作用于Cyp-D使目的蛋白的构象发生变化，这些构成了MPTP高水平开放的内环境，MPTP不可逆的高水平通透，使相对分子质量＜1500×103的物质都可以通过线粒体内膜，Ca2+也更加快速地涌入线粒体内，进一步加重线粒体内的钙超载［8］。

1.2 电子传递链与MIRI

ETC由4个酶复合物Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ以及电子载体(辅酶Q和细胞色素c)组成，复合物Ⅰ和Ⅲ是产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的主要部位［9］。MIRI对线粒体传递链的破坏主要是引起H+从复合物Ⅰ和Ⅲ漏出，复合物Ⅰ，Ⅲ和Ⅳ共同作用将H+从线粒体基质转移到膜间隙使线粒体△ψm改变，并传递一个电子给超氧自由基，使ROS生成增加［10］。大量ROS攻击线粒体的膜系统，使脂质过氧化破坏心磷脂，细胞色素c从线粒体外膜释放，导致膜结构破坏［11］。最近有研究结果表明，△ψm在MIRI时异常去极化与ROS的破坏作用同时发生［12］，而ROS的增加和再灌注后△ψm快速复极化诱发线粒体内膜通透性的非特异性升高，即MPTP开放，细胞质中的Ca2+大量流入线粒体内，由于细胞质内钙超载，线粒体膜上转运蛋白在缺血期受损，能量供应障碍等都造成线粒体释放Ca2+障碍，Ca2+摄取和释放失衡导致线粒体内Ca2+超载。线粒体内Ca2+浓度增高，激活钙依赖性磷脂酶，水解膜磷脂;游离的Ca2+与磷酸结合生成磷酸钙沉着于线粒体内，使线粒体膜结构受损，加重线粒体功能障碍。而线粒体内Ca2+超载，又激活Ca2+依赖性蛋白酶，使黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)大量生成，ATP消耗的分解产物次黄嘌呤和黄嘌呤大量堆积。再灌后，在XO作用下次黄嘌呤转变为尿酸过程中所释放的电子使氧分子形成O2－。这样，线粒体内Ca2+超载和ROS损伤相互作用，形成恶性循环。

1.3 线粒体钾通道与MIRI

线粒体钾通道包括线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels，mitoKATPC)和钙敏感性钾通道(mitochondrial calcium-sensitive potassium channels，mitoKCaC)。mitoKATPC是线粒体内在重要的保护组分，由4个内向整流钾通道(Kir)亚单位和4个磺酰脲受体(sulfonylurea receptor，SUR)亚单位组成的异源性八聚体［13］。其保护机制主要体现在:①改变线粒体的能量代谢状态。当线粒体基质中ATP含量不足时mitoKATPC开放，K+大量进入线粒体，线粒体基质容积增加，激活电子传递链，促进线粒体呼吸链合成ATP增加。②减轻Ca2+超载。K+内流进入线粒体降低了内膜电位差，减小Ca2+内流的动力;同时mitoKATPC开放，部分Ca2+从线粒体进入胞质，减轻线粒体钙超载。③抑制ROS生成。Costa等［14］发现，mitoKATPC开放在缺血期通过激活蛋白激酶C少量增加ROS的生成而发挥心肌保护作用;再灌注时mitoKATPC开放又能抑制ROS的爆发，减少ROS对细胞的不可逆损伤。而mitoKCaC则是位于mitoKATPC旁，对Ca2+有依赖性的钾通道［15］，它对心肌的保护作用一方面通过阻碍MPTP开放，减轻Ca2+内流，另一方面通过显著降低线粒体呼吸链的氧化产物，减小梗死面积实现［16］。而开放MPTP使mitoKCaC所诱导的心肌保护作用减弱的现象反过来又说明mitoKCaC可能位于MPTP的上游［17］。

1.4 Bcl-2蛋白家族与MIRI

线粒体是Bcl-2相关蛋白家族的主要寄存位点，这一家族有多个成员，既有抗凋亡蛋白Bcl-2又有促凋亡蛋白Bax。Bcl-2蛋白能诱发内膜释放抗凋亡蛋白［12］;而Bax的促凋亡作用与细胞色素c，Smac/DIABLO，htrA2/Omi蛋白酶，核酸内切酶G等密切相关。在MIRI中，ATP供应缺乏，ROS和Ca2+相互协同等共同作用致使MPTP开放，线粒体结构和功能重塑从而刺激线粒体启动凋亡系统，凋亡蛋白Bax向线粒体附近迁移，并且VDAC-2对其抑制作用解除，Bax在线粒体外膜内发生寡聚化，使细胞色素c和其他凋亡蛋白释放至细胞质。细胞色素c与凋亡蛋白活化因子(apoptotic protein activating factor，Apaf-1)形成多聚体复合物，进而募集胱天蛋白酶9，且一个活化的Apaf-l可募集多个胱天蛋白酶9，并使其自我剪切和活化，从而启动胱天蛋白酶的级联反应，激活下游的胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7。胱天蛋白酶3是调节和执行细胞凋亡的最重要蛋白酶之一，可引起DNA损伤修复酶降解，同时激活核酸内切酶，使细胞凋亡。此外Ca2+超载，能活化Ca2+依赖的核酸内切酶、蛋白酶、蛋白激酶，并调节磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的活性，使整个细胞结构破坏，功能丧失，产生细胞凋亡。

2 线粒体作为靶点在MIRI治疗中的作用

2.1 以MPTP为靶点的治疗策略

鉴于MPTP在MIRI中的关键作用，近年来，以MPTP为治疗靶点的研究已成为MIRI治疗策略中的热点。MPTP 3个组成部分(VDAC，ANT，CyP-D)均可分别成为药物作用靶点，通过抑制MPTP的开放而发挥治疗作用:①VDAC主要释放细胞色素c，而细胞色素c是细胞凋亡的启动信号，研究发现，己糖激酶与VDAC结合，可影响MPTP的开放，从而起到诱导或阻止细胞凋亡的作用，Bcl-2可以使VDAC关闭而抑制MPTP开放［18］。②ANT介导ADP和ATP的交换，将ATP转运到细胞质中。苍术苷是ANT的一种特异性配体，能降低基质ADP与ANT结合的能力，使ANT构象发生变化而抑制MPTP开放。抗氧化剂也是通过抑制MPTP开放而发挥治疗作用的［19］，如局部抗缺血药物美弗拉奉(meferaven)可能是通过作用于ANT，使自由基不能与ANT上的硫醇基团结合，从而使MPTP关闭产生心肌保护作用。③Cyp-D在钙超载的情况下与ANT结合，使其构象发生变化而丧失核苷酸载体的能力。环孢素A是经典的MPTP抑制药［20］，它与Cyp-D结合，形成Cyp-A复合物从而阻碍Cyp-D与ANT结合，最终抑制MPTP的开放。

2.2 以线粒体钾通道为靶点的治疗策略

通过药物干预，提高mitoKATPC的活性，促进其开放是近来治疗缺血再灌注损伤的新方向。二氮嗪是mitoKATPC特异性开放剂的代表药物，且对线粒体上mitoKATPC的作用比其他膜结构强大，它对心肌的保护作用与mitoKATPC开放有关，通过使线粒体K+内流，基质容量增加，激活氧化呼吸链使能量生成增加，减轻钙超载，同时通过mitoKATPC介导减少丙二醛的生成，使ROS合成减少从而起到细胞保护作用。除了二氮嗪，麻醉剂异丙酚和挥发性麻醉剂异氟烷也是通过促进mitoKATPC开放发挥治疗MIRI作用的。虽然异丙酚是否能抑制Ca2+超载尚存在争议，但有研究证实它可通过KATPC介导抑制氧化应激，上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，下调促凋亡蛋白Bax表达而保护线粒体，干扰线粒体途径的细胞凋亡最终改善MIRI时心肌的功能状态［22］。而抑制KATPC能改变MIRI中异氟烷介导的改善心肌收缩功能的作用，所以他们认为异氟烷对MIRI的保护作用可能是选择性地激活KATPC的保护机制、预防心肌蛋白水解而起作用的［22］。

与mitoKCaC相关的药物治疗报道较少，NS1619是该通道的激动剂，Stowe等［23］证实它使mitoKCaC开放，降低线粒体内钙超载和氧自由基的产生，保护心肌细胞，减小梗死面积。Chen等［24］证实吗啡预处理治疗MIRI的作用机制是通过PI3K通路使mitoKCaC开放，减少钙超载，进而缩减心肌梗死面积的。

2.3 其他治疗策略

除上述3种主要作用靶点外，线粒体上还存在着其他多个药物作用靶点，如抗凋亡蛋白家族Bcl-2，很多药物通过上调其表达起到抗细胞凋亡的作用。此外，对一些多靶点治疗药物和手段的研究也是目前的热点，如胺碘酮，既可以抑制线粒体内钙超载，又能够通过抑制MPTP开放而抑制缺血/再灌注心肌细胞凋亡。

缺血预处理是治疗MIRI重要手段，其机制目前尚未明确，有报道认为可能与G蛋白耦联受体，级联蛋白激酶及mitoKATPC等多种因素和信号通路有关，并且它们之间可以相互影响共同参与缺血预处理对MIRI的治疗［25］。蛋白激酶C通过调节线粒体K+/Ca2+通道使线粒体膜电位去极化，抑制MPTP开放，促mitoKATPC开放，减轻线粒体钙超载［26］。进一步的研究证实，蛋白激酶C的保护作用与热激蛋白90有关［27］。近来，更多研究证实高含氧量预适应能减小心肌梗死面积和提高心肌功能，这种保护作用是通过开放mitoKATPC，降低氧自由基的产生实现的［28］。同时高含氧量预适应过程中mitoKATPC开放能阻碍MPTP开放和细胞色素c释放，从而减少Ca2+内流，降低线粒体内钙超载，并能减少ROS的生成［29］。虽然预处理是临床报道防治MIRI的有效手段，但由于此过程会使心肌某些方面的损伤加重，临床应用也受到很大限制。

3 展望

鉴于线粒体在MIRI中的重要地位，其相关研究已成为MIRI研究热点。然而，线粒体的分子结构，特别是与MIRI有关的分子结构、生理功能及以其为治疗靶点的药理作用机制尚未完全阐明;目前关于线粒体的药理研究多集中在单一药物和单一作用靶点，这使以线粒体为靶点的治疗受到了限制。因此，进一步明确线粒体在MIRI中的重要作用，探索与之相关的多靶点药物治疗，研究药物的多靶点作用及不同作用靶点药物联合应用的作用机制是MIRI治疗策略的发展方向，同时也为临床治疗提供理论依据。

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Progress of role of mitochondria in myocardial ischemic-reperfusion injury

YANG Yi-ping，LUO Yuan，FAN Li-bing，WANG Yong-an
(1.Department of Military Toxicology and Biochemical Pharmacology，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China;2.Department of Biological Sciences，Anhui Medical University，Anhui230032，China)

Short supply of cellular energy is one of the critical factors for myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI).As an energy supply center of cells，mitochondria are closely related to ischemia-reperfusion injury.Its dysfunction may cause serious damage to the cardiac cells during ischemia and reperfusion while it can also initiate a protection mechanism to reduce MIRI.So far，the role of mitochondria in MIRI has been developed to a molecular level.Therefore，as a target of therapeutic strategies，some molecules of mitochondria，such as mitochondrial permeability transition pore，mitochondrial ATP-sensitive potassium channels，have become a research focus related to MIRI.In this paper，the relationship between mitochondria and MIRI，as well as the drug research of mitochondria，is reviewed.

mitochondria;myocardial ischemia-reperfusion injury;treatment targets

WANG Yong-an，E-mail:yonganw@sina.com，Tel:(010)66874607

R966

A

1000-3002(2012)04-0577-04

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.019

杨一萍(1983－)，女，硕士研究生，主要从事药理毒理学研究;王永安(1973－)，男，博士，副研究员，主要从事药理毒理学研究。

王永安，E-mail:yonganw@sina.com，Tel:(010)66874607

2011-03-15接受日期:2011-07-11)

(本文编辑:乔虹)