lactuside B降低脑缺血损伤大鼠海马和纹状体TRPM7 mRNA的表达

詹合琴，贾岩龙，闫福林，牛秉轩，尹延彦

(新乡医学院药学院1.药理教研室，2.药物化学教研室，3.综合办公室，河南新乡453003)

lactuside B降低脑缺血损伤大鼠海马和纹状体TRPM7 mRNA的表达

詹合琴1，贾岩龙1，闫福林2，牛秉轩1，尹延彦3

(新乡医学院药学院1.药理教研室，2.药物化学教研室，3.综合办公室，河南新乡453003)

目的探讨lactuside B对大鼠脑缺血损伤后海马和纹状体TRPM7 mRNA表达的影响。方法采用大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，SD雄性大鼠缺血2 h后再灌，分别于再灌后ip给予lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1，每天2次，每组1/2大鼠给药1 d，另1/2大鼠连续给药3 d，于末次给药后观察神经缺失症状并处死大鼠;RT-PCR技术检测大脑皮质和海马TRPM7 mRNA的表达。结果模型组大鼠各时间段神经缺失症状评分明显升高，海马和纹状体的TRPM7 mRNA表达均显著增加(P＜0.01)。给予lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－11 d后，海马和纹状体TRPM7 mRNA表达分别为0.68±0.02，0.55±0.02和0.56±0.02，及0.32±0.02，0.25±0.01和0.35±0.01，与模型对照组比较均明显降低(P＜0.01);给予lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－13 d，海马和纹状体TRPM7 mRNA分别为0.29±0.02，0.18±0.01和0.26±0.01，及0.28±0.02，0.19±0.01和0.27±0.01，与模型对照组比较均明显降低(P＜0.01)。结论lactuside B可降低海马和纹状体TRPM7基因的表达，提示该化合物对脑缺血损伤可能具有治疗作用。

lactuside B;再灌注损伤，脑;海马;纹状体;TRPM7阳离子通道

脑缺血的发病机制异常复杂，以往认为与兴奋性神经递质谷氨酸的大量释放、导致神经细胞内钙超载并最终引起细胞损伤和死亡有关［1－2］。然而，抗兴奋性中毒疗法(anti-excitotoxic therapies，AET)的临床试验结果却不能使人满意，甚至还有较多的不良反应出现［3－4］。

近年来，人们发现与脑缺血治疗靶点相关的非谷氨酸机制能够使离子失衡导致细胞死亡。体内研究表明，酸敏感膜通道和瞬时型受体电位通道中的瞬时型受体电位黑素抑素7(transient receptor potential melastatin 7，TRPM7)和容量调整阴离子通道等非谷氨酸机制参与了脑缺血的发病过程［5－6］，但TRPM7对脑缺血的影响更使人关注。

脑缺血时钙超载激活了一氧化氮合酶，使一氧化氮和过氧化物等大量产生，引起TRPM7活性增强和过度表达。有研究表明，TRPM7通道在缺氧缺糖神经元死亡过程中发挥重要作用［7］，提示兴奋性氨基酸受体拮抗剂不能阻断TRPM7激活后所致的损害，不能改善AET对脑缺血治疗的局限性，故寻找作用于非谷氨酸机制的抗脑缺血药物具有十分重要的意义。

3β-葡萄糖-14-羟基-11β，13-二氢木香烯内酯(lactuside B)是从河南桐柏高翅果菊植物地下部分中分离提取的主要化学成分，本课题组前期研究发现，该单体化合物具有良好的抗脑缺血作用［8－9］。鉴于TRPM7通道对脑缺血损伤具有重要的影响，故本研究主要探讨lactuside B对大鼠脑缺血后脑组织海马和纹状体TRPM7基因表达的影响，以期从多部位多方面观察该单体化合物抗脑缺血损伤的分子效应。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

lactuside B由新乡医学院药学院天然药物化学教研室提供，为黄白色粉末，纯度＞96%;尼莫地平注射液购自山东方明药业股份有限公司;上样缓冲液(6×)和RT-PCR试剂盒购自宝生物工程大连有限公司;TAE缓冲液购自广州威佳科技有限公司，DEPC液和溴化乙锭购自美国Sigma公司;D2000DNA分子量标志物购自北京天根生化有限公司;Trizol购自美国Invitrogen公司;水合氯醛粉剂购自天津市瑞金特化学品有限公司。SYQ-DSX-280B立式电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂;79-2型磁力加热搅拌器，江苏金坛市佳美仪器有限公司;Hfsafe-1200生物安全柜，西化仪北京科技有限公司;AG PCR扩增仪，德国Eppendorf公司;DYY-7C型水平电泳仪，北京市六一仪器厂;TGL-16G-A台式高速低温离心机，上海安亭科学仪器厂;MDFU4086S超低温冰箱，日本Sanyo公司;UV-2102PC紫外分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司;TOCAN240凝胶成像系统，上海领成生物科技有限公司。

1.2 动物及缺血性脑损伤模型的制备

健康雄性SD大鼠(清洁Ⅱ级)，体质量280～320 g，由河南省实验动物中心提供，合格证号:SYXK(豫)2005-0012。参照Longa线栓法［10］制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型(麻醉采用10%水合氯醛)，将预先制备好的阻塞线(1.5号日本渔线，直径0.2 mm，长2 cm)从颈内动脉插入到大脑中动脉，使其头端阻塞大脑中动脉入口。假手术组阻塞线只插入颈内动脉0.5 cm长，然后将大鼠伤口缝合后回笼饲养。所有大鼠均阻塞2 h后再把阻塞线球端拉回到颈外动脉进行再灌注。

1.3 实验分组和给药

大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平1 mg·kg－1组、lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1组，每组8只(由于脑缺血再灌注损伤模型大鼠的死亡率较高，故按每组大鼠多出1/2来分，剔除模型失败和死亡的大鼠，使存活大鼠至少达到8只)。于缺血2 h后再灌注，均ip给予5 ml·kg－1，每天2次，每组1/2大鼠给药1 d，另1/2大鼠连续给药3 d，于末次给药后分别处死相应的大鼠取脑备用。

1.4 Zea-Longa评分法［10］进行神经功能评分

实验大鼠于手术清醒和末次给药后分别进行神经功能缺失症状评分，前者进行评分主要是判断模型的成功性，后者评分主要是观察药物的抗脑缺血损伤作用。

1.5 RT-PCR法检测TRPM7基因表达水平

处死大鼠取脑，迅速分离出双侧海马和纹状体(取壳核和尾状核的全部条纹状组织)结构，Trizol法抽提总RNA，并检测其纯度和浓度保证提取的RNA无降解和污染。用TaKaRa pimeScript TM RT-PCR试剂盒合成cDNA模板，以β肌动蛋白作为内参。PCR反应溶液为50 μl。TRPM7，661bp，F:5'-CTGAAGAGGAATGACTACAC-3'，R:5'-ACAGGGAAAAAGAGAGGGAG-3';β肌动蛋白，208 bp，F:5'-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3'，R:5'-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'，各0.5 μl(100 μmol·L－1)。PCR反应条件为:95℃预变性5 min，95℃变性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后一个循环结束后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳40 min后，用UVP凝胶成像系统观察并摄图，以Quantity One图像分析软件测定各条带灰度，用扩增的特异性目的片段灰度值和同时扩增的内参β肌动蛋白片段灰度值的比值作为特异性扩增目的片段的半定量检测值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 lactuside B对大鼠神经缺失症状评分的影响

表1结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠神经缺失症状评分均增高(P＜0.01)。与模型组比较，给药1 d和3 d后，lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1组大鼠的神经行为学评分均降低(P＜0.01)，同时lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1组神经行为学评分明显好于尼莫地平1 mg·kg－1组(P＜0.05，P＜0.01);lactuside B 25和50 mg·kg－1组用药3 d后大鼠的神经缺失症状评分更低，与给药1 d比较差异显著(P＜0.05)。

Tab.1 Effect of lactuside B on neurologic deficit score of ischemia/reperfused(I/R)rats

2.2 lactuside B对大鼠大脑海马TRPM7 mRNA表达的影响

表2和图1数据显示，模型组大鼠脑缺血再灌注损伤后海马TRPM7 mRNA表达增加，与假手术组比较有显著性差异(P＜0.01)。与模型组比较，给予lactuside B 25和50 mg·kg－11 d时，TRPM7 mRNA表达显著降低(P＜0.01)，给药3 d时，lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1组TRPM7 mRNA表达均降低(P＜0.01)，且25 mg·kg－1组优于尼莫地平1 mg·kg－1组(P＜0.01);除假手术组外，其他各组用药3 d与用药1 d相比均有显著性差异。)

Tab.2 Effect of lactuside B on TRPM7 mRNA expression in hippocampus of I/R rats

See Tab.1 for the treatment.TRPM7 mRNA expression was detected by RT-PCR for hippocampus.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with sham group;##P＜0.01，compared with model group;△△P＜0.01，compared with model+nimodipine group;▲▲P＜0.01，compared with corresponding administered for 1 d group.

Fig.1 Effect of lactuside B on TRPM7 mRNA expression in hippocampus of I/R rats by RT-PCR.See Tab.1 for the treatment.A:administered for 1 d;B:administered for 3 d.1:sham group;2:I/R model group;3:I/R model+nimodipine 1 mg·kg－1;4:I/R model+lactuside B 12.5 mg·kg－1;5:I/R model+lactuside B 25 mg·kg－1;6:I/R model+lactuside B 50 mg·kg－1.

2.3 lactuside B对大鼠大脑纹状体TRPM7 mRNA表达的影响

如表3和图2数据显示，模型组大鼠脑缺血再灌注损伤后纹状体TRPM7 mRNA表达增加，与假手术组比较有显著性差异(P＜0.05)。给药1 d时，与模型组比较，lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1组TRPM7 mRNA表达均显著降低(P＜0.05，P＜0.01);lactuside B 25 mg·kg－1组与尼莫地平组比较有显著性差异(P＜0.01)。给药3 d时，与尼莫地平组比较，lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1组均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01);除假手术组和lactuside B 12.5 mg·kg－1组外，其他各组用药3 d与用药1 d相比均有显著性差异。

Tab.3 Effect of lactuside B on TRPM7 mRNA expression in striatum of I/R rats

Fig.2 Effect of lactuside B on TRPM7 mRNA expression in striatum of I/R rats.See Tab.1 for the treatment.A:administered for 1 d;B:administered for 3 d.1:sham group;2:I/R model group;3:I/R model+nimodipine 1 mg·kg－1;4:I/R model+lactuside B 12.5 mg·kg－1;5:I/R model+lactuside B 25 mg·kg－1;6:I/R model+lactuside B 50 mg·kg－1.

3 讨论

近年来，TRPM7与脑缺血损伤的病理生理关系已成为研究热点。一些研究表明，局灶性脑缺血再灌注损伤可诱导大鼠海马和皮质组织TRPM7的表达水平增加［11］。Lee等［12］研究发现，TRPM7通道在脑缺血期除了使Ca2+增高外还可使Zn2+增高;Koh等［13］发现，在脑缺血损伤后很短的时间内，海马CA1区细胞在死亡之前，细胞内的Zn2+有一个延迟的增加。最近研究表明，由TRPM7介导的Zn2+诱导的神经毒性很大［14］。也有研究表明，当脑缺血损伤NMDA受体过度激活时，则形成钙超载，活性氧自由基增多，TRPM7通道激活，钙进入细胞内加重超载的恶性循环［7］。以上研究结果充分提示，研究抗脑缺血损伤的药物lactuside B可从TRPM7的作用靶点去考虑。

本研究结果显示，模型组大鼠神经缺失症状评分均增高，与假手术组比较有显著性差异，但随时间延长，神经缺失症状评分有所下降，与给药1 d比较无显著性差异。lactuside B各剂量组均可降低大鼠的神经行为学评分，且其各剂量组在给药1 d和3 d时均明显好于尼莫地平1 mg·kg－1组，但只有lactuside B 25和50 mg·kg－1组用药3 d后大鼠的神经缺失症状评分更低，与给药1 d比较差异显著，提示lactuside B能有效改善脑缺血损伤后动物的神经缺失症状。

本研究RT-PCR实验结果显示，脑缺血损伤后大鼠海马和纹状体的TRPM7 mRNA表达明显增多，但随时间延长，其表达却有下降趋势，可能为脑组织对缺血性损伤的反应性降低所致，此结果与以往研究相一致。结果又显示，lactuside B各剂量组均能降低海马和纹状体TRPM7 mRNA的表达水平，但lactuside B 50 mg·kg－1组却作用较差，与大鼠的神经功能评分结果并不一致，可能是lactuside B的抗脑缺血损伤作用尚有其他机制，也或是实验中出现的其他未知因素所致。总体上，lactuside B各剂量组脑缺血损伤后海马和纹状体组织TRPM7基因的表达降低，对脑缺血损伤产生了积极的影响，且有些剂量组在某些时间点强于尼莫地平。但是，实验中还发现，给药3 d后除假手术组外，其他各组降低TRPM7的作用几乎均强于给药1 d，而大鼠的神经缺失症状评分结果却显示出模型组用药1 d和3 d并无显著性差异，提示实验结果存在着不一致的情况。由于模型组的TRPM7降低有时效差异性，故lactuside B作用的时效性或无实际意义。

综上所述，lactuside B的抗脑缺血作用与降低海马和纹状体TRPM7基因的表达有较大关系，该单体化合物可能通过调控TRPM7基因的表达来改变其指导功能蛋白质的合成数量，调控细胞内以钙离子为主的阳离子浓度，从而影响脑缺血的病理过程。lactuside B对脑缺血损伤后TRPM7基因表达的影响使抗脑缺血药物的研发范围和作用靶点进一步扩大，对于其开发价值和应用前景有着显著的意义。

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Inhibitory effect of lactuside B on TRPM7 mRNA expression in hippocampus and striatum in cerebral ischemic rats

ZHAN He-qin1，JIA Yan-long1，YAN Fu-lin2，NIU Bing-xuan1，YIN Yan-yan3
(1.Department of Pharmacology，2.Department of Medicinal Chemistry，3.General Office，School of Pharmacy，Xinxiang Medical University，Xinxiang453003，China)

OBJECTIVETo explore the effect of lactuside B on transient receptor potential melastatin 7(TRPM7)mRNA expression in rat hippocampus and striatum after cerebral ischemia injury.METHODSThe middle cerebral artery occulsion was used to make the ischemia(2 h)reperfusion injury model.After reperfusion，the rats were respectively ip given lactuside B 12.5，25 and 50 mg·kg－1twice daily.Half of the rats of each group administered for 1 d while the rest administered continuously for 3 d.After the neurologic deficit score was observed in the last administration，the rats were sacrificed.The expression of TRPM7 mRNA on hippocampus and striatum was detected by RT-PCR.RESULTSCompared with sham group，the neurological lack symptom score in model group was significantly higher and the TRPM7 mRNA expression increased in hippocampus and striatum in rats.After lactuside B 12.5，25 and 50 mg·kg－1was administered for 1 d，TRPM7mRNAexpressionwasdecreasedinhippocampusandstriatum(hippocampus:0.68±0.02，0.55±0.02 and 0.56±0.02;striatum:0.32±0.02，0.25±0.01 and 0.35±0.01).TRPM7 mRNA expression was lower after lactuside B administered for 3 d(hippocampus:0.29±0.02，0.18±0.01 and 0.26±0.01;striatum:0.28±0.02，0.19±0.01 and 0.27±0.01).CONCLUSIONLactuside B can reduce TRPM7 gene expression in hippocampus and striatum，suggesting that lactuside B play a positive therapeutic and protective role.

lactuside B;reperfusion injury，brain;hippocampus;striatum;TRPM7 cation channel

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81172953);Natural Science Research Foundation of Henan Bureau of Education(2009A310009)

ZHAN He-qin，E-mail:xiaofei1@126.com，Tel:13781966576

R285

A

1000-3002(2012)04-0489-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.004

国家自然科学基金(81172953);河南省教育厅自然科学研究基金(2009A310009)

詹合琴(1967－)，女，硕士，副教授，硕士生导师，主要从事神经药理学研究。

詹合琴，E-mail:xiaofei1@126.com，Tel:(0373)3029101

2011-11-16接受日期:2012-03-20)

(本文编辑:乔虹)