微波辅助萃取–液相色谱–串联质谱法测定植物源产品中的阿维菌素B1a残留量

蒋宏 胡贝贞，宋伟华

（建德市质量计量监测中心，浙江建德 311600） （绍兴出入境检验检疫局，浙江绍兴 312000）

微波辅助萃取–液相色谱–串联质谱法测定植物源产品中的阿维菌素B1a残留量

蒋宏 胡贝贞，宋伟华

（建德市质量计量监测中心，浙江建德 311600） （绍兴出入境检验检疫局，浙江绍兴 312000）

建立了植物源产品茶叶、粮谷、中药材中阿维菌素B1a残留量的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定方法。样品用丙酮-二氯甲烷（体积比1∶1）微波辅助提取，提取液经石墨化炭黑/氨基（Carb/NH2）固相萃取小柱净化。采用Hypersil Gold C18色谱柱（150mm×2.1 mm，5μm），乙腈-2.5 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相，以电喷雾电离正离子（ESI+）、多反应监测模式（MRM）定性、定量测定阿维菌素B1a，采用基质标准曲线外标法定量。在5～100μg/L范围内，阿维菌素B1a的峰面积与质量浓度呈线性关系，相关系数大于0.998，方法的检出限（S/N＞3）为5 μg/kg，定量限（S/N＞10）为10μg/kg。取有代表性的绿茶、小麦、丹参阴性样品进行加标回收试验，在10，50μg/kg加标水平下，回收率为75%～87%，相对标准偏差为4.04%～6.38%(n=5)。该法提取效果好、净化较彻底，灵敏度满足国内外限量标准的要求，适合复杂基质植物源产品中阿维菌素B1a残留量的测定。

微波辅助萃取；液相色谱-串联质谱；植物源产品；阿维菌素B1a

阿维菌素类生物农药是从链霉菌的发酵产物中分离出来的大环内酯类抗生素，对动植物的寄生线虫和节肢动物均有高效的驱杀作用，是一种优良的新型农畜两用抗生素，广泛用于作物种植与动物养殖中［1］。这类药物包括阿维菌素（Avermectin，AVM）、伊维菌素、多拉菌素、莫西菌素、乙酰基阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐等。阿维菌素根据取代基不同可分为 A1a，A1b，A2a，A2a，B1a，B1b，B2a，B2b 8个组分，其中B1a的活性最强，故把B1a（≥80%）和B1b（≤20%）合称作阿维菌素（Avermectin B1）［2］。阿维菌素作为甲胺磷等高毒有机磷农药的替代品广泛用于蔬菜、果树、棉花、花卉等，目前已在很多国家登记使用。

阿维菌素虽属于微生物源农药，但是按世界卫生组织5级分级标准，仍属高毒农药，对哺乳动物的繁殖能力具有潜在毒性［3］。因此，国际上对阿维菌素残留的检测十分重视，制订了严格的残留限量，如欧盟详细规定了其在果蔬、谷物中的残留限量为10μg/kg，欧盟法规（EC）No.149/2008规定了茶叶中阿维菌素B1a的残留限量为20μg/kg，日本则不允许将阿维菌素用于茶叶种植中。

阿维菌素相对分子质量大，极难气化，尚无可行的气相色谱衍生化方法，检测方法主要有液相色谱 - 荧光检测法［4，5］和酶联免疫法［6］，前者较常用，但需要繁琐的衍生化反应；后者则存在假阳性现象，只能用于筛选，不能作为确证方法。近年来，LC-MS-MS方法(电喷雾或大气压化学电离)测定阿维菌素屡见报道［7-10］。这些方法主要集中在动物源食品或单一、简单的基质，净化过程较简单、不彻底，而茶叶、中药材等产品含有大量的色素、蜡质、有机酸、生物碱等各种复杂的化学成分，再加上残留的农药浓度通常较低，造成这些产品中阿维菌素的提取、分离、净化与富集的难度较大，需要有针对性地探索一套适合的分析方法。

笔者在前人研究的基础上，选取阿维菌素中活性最大的B1a组分为研究对象，选用具有萃取效率高、成本低、污染小等优点的微波辅助萃取法，并对净化条件和质谱、色谱检测条件进行优化，建立了茶叶、粮谷、中药材3种植物源基质中阿维菌素B1a的测定方法，该方法提取效果好，净化较彻底，灵敏度满足欧盟、日本等国的残留限量要求。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪：TSQ Quantum Acess三重四极杆型，美国Thermo Fisher公司；

微波萃取仪：Mars X Press型，美国CEM公司；

纯水发生器：Elix5型，美国M illipore公司；

超纯水发生器：SYNERY型，美国M illipore公司；

氮吹仪：N-EVAP-12型，美国Organomation公司；

超离心研磨仪：ZM 200型，德国莱驰公司；

分析天平：PL-203型，瑞士梅特勒公司；

阿维菌素B1a标准溶液：100μg/m L，农业部环境保护科研监测所，使用时用丙酮稀释；

Carb/NH2固相萃取小柱：500mg/500mg/(6 m L)，杭州福裕科技服务有限公司，使用前用3 m L丙酮－二氯甲烷（体积比1∶1）预活化；

乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸铵：色谱纯，美国TEDIA公司；

乙酸铵水溶液：2.5 mmol/L，称取0.077 g乙酸铵，加适量超纯水溶解后定容至1 000m L；

尼龙微孔过滤头：孔径0.22 μm，北京振翔公司；

实验用水：超纯水。

1.2 仪器分析条件

（1）液相色谱条件

色谱柱：Hypersil Gold型C18色谱柱（150mm×2.1 mm，5 μm）；柱温：25℃；进样量：10μL ；流动相：乙腈-2.5 mmol/L乙酸铵水溶液，流速为200μL/m in，梯度洗脱程序见表 1。

表1 梯度洗脱程序

（2）质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：4 000V；雾化气：高纯氮气，241.3 kPa；辅助气：高纯氮气，34.5 kPa；碰撞气：高纯氩气，0.2 Pa；阿维菌素B1a母离子：m/z 890.6，子离子m/z 305.1，m/z 567.4；碰撞电压：30，12 V；定量离子对为m/z 890.6→ 305.1。

1.3 样品处理方法

（1）提取

将样品用超离心研磨仪粉碎，过0.5 mm筛。称取0.5 g样品（精确至0.01 g），装入微波萃取罐中，加入15 m L丙酮-二氯甲烷（体积比1∶1），放入微波萃取仪中进行萃取。微波萃取条件：5 min内升温至60℃，保持5 m in，然后在5 m in内升温至90℃，保持15 m in，微波功率为400W。萃取完毕，将萃取液过滤至50m L圆底玻璃烧瓶中，残渣再加15 m L溶剂重复上述提取步骤再提取一遍，合并萃取液，于35℃水浴中旋转蒸发至约1 m L，待净化。

（2）净化

将上述（1）中的待净化液加入到已活化好的Carb/NH2固相萃取小柱上，用约1 m L丙酮-二氯甲烷（体积比1∶1）洗涤烧瓶，洗涤液加到小柱上。待净化液全部过柱后，再加5 m L丙酮-二氯甲烷（体积比1∶1）洗脱，用10m L刻度离心管收集所有流出物，于45℃水浴中氮气吹干，残渣用0.5 m L乙腈-2.5 mmol/L乙酸铵水溶液（体积比1∶1）溶解后过0.22 μm尼龙微孔过滤头，供LC-MS-MS测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱、色谱条件的优化

阿维菌素B1a在电喷雾电离（ESI）或大气压化学电离（APCI）源下均能获得可靠的母离子和子离子，考虑到大多数农药分析在ESI模式下进行，在仅有一台仪器的情况下切换离子源比较繁琐，故实验选择ESI电离源。在ESI+模式下，阿维菌素B1a的加合离子峰主要有［M+NH4］+和［M+Na］+。在流动相存在的情况下进行质谱条件优化，分别以乙腈-水（体积比1∶1）和乙腈-0.1%甲酸（体积比1∶1）为流动相时进行试验，发现阿维菌素B1a的加合离子峰主要为［M+Na］+，但强度弱，灵敏度较差，而在流动相中加入5 mmol/L乙酸铵时，发现加合离子峰主要为［M+NH4］+，且强度大大增加，因此在流动相中添加乙酸铵，选择信号强且稳定的［M+NH4］+加合离子峰作为母离子。

研究表明，过高的离子浓度对分析物的电离具有较强的抑制作用，因此，为提高灵敏度，有必要对质谱分析时的缓冲盐浓度进行优化。考察了缓冲盐及酸的浓度对分析物信号强度的影响，选用的水相流动相分别为5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸，5，2.5，1 mmol/L 乙酸铵，将 10μg/L 的阿维菌素B1a标准溶液进样分析。结果表明，加入0.1%甲酸对信号有抑制作用，当乙酸铵浓度为2.5 mmol/L时分析物相应信号最强；当乙酸铵浓度为1 mmol/L时信号略有下降。为取得较高灵敏度，选择乙腈-2.5 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相。

2.2 提取条件的选择和优化

微波萃取是近年来发展起来的快速提取方法，是目前国际上推崇的有机物提取手段之一［11，12］。因此优选微波萃取(MAE)法，并将其与加速溶剂萃取(ASE)法进行对比。因实验中无法获得含有阿维菌素B1a的阳性样品，笔者由实际检测工作中茶叶阳性样品中其余农药萃取时所得经验可知，两种萃取方式均能有效地将残留农药提取出来，为使残留物提取完全，均需对残渣进行二次提取。由于ASE是单个样品依次提取，而MAE能同时萃取一批样品，为了节约萃取时间，选择MAE萃取法。

2.3 净化条件的优化

茶叶、中药材、谷物中色素含量较高，是主要的干扰杂质，另外还有脂肪、有机酸、蜡质等杂质。采用文献所用的C18小柱、QuEChERS（加C18粉）、液液萃取等净化方法均无法有效去除杂质，易导致仪器受污染，且基质效应十分突出。凝胶渗透色谱（GPC）净化是去除色素、脂肪、蜡质等大分子杂质的有效手段，但实验中发现由于阿维菌素B1a的相对分子质量较大，不能与大部分色素有效分离，无法用GPC净化。石墨化炭黑/氨基小柱是去除色素时最常用的小柱，但不同生产商的石墨化炭黑对目标物的吸附性能不同，实验选用的石墨化炭黑/氨基小柱能用低沸点的丙酮-二氯甲烷洗脱目标物，色素等能被有效去除，净化效果好，又有利于后续氮吹浓缩，仅用5 m L就能将阿维菌素B1a洗脱下来。

由于采用微波萃取提取效率高，大量杂质同时被提取出来，小柱易过载。实验发现茶叶样品提取液杂质特别多，1.0g样品提取液会导致500mg/500mg规格的小柱过载，0.5 g样品则不会，所以实验选择称取0.5 g样品。

2.4 基质效应考察

取阴性的绿茶、小麦、丹参样品，按1.3步骤处理，获得0.5 m L空白基质液。阿维菌素B1a储备液用丙酮逐级稀释至 10μg/L，取 100μL 此标准溶液4份，室温下在氮气流下缓慢蒸干丙酮，取第1份加入初始流动相乙腈-2.5 mmol/L乙酸铵水溶液（体积比 1∶1），取2，3，4份分别加入上述3种空白基质液，重新溶解后进样测定，对比基质标样与纯溶剂标样的响应值，见图1。结果表明，阿维菌素B1a在3种样品基质存在时，响应值均有不同程度提高，存在较强的基质增强效应。为了准确定量，需要用基质标准曲线定量。

2.5 线性关系、检出限、定量限

用丙酮配制浓度为 5，10，25，50，100μg/L 的系列阿维菌素B1a标准工作溶液，各取100μL，室温下于氮气流中缓慢蒸干丙酮，取2.4中空白基质液，向每个浓度点的标准溶液中加入100μL空白基质液重新溶解，获取系列基质标准溶液，进样测定，以响应值Y为纵坐标，浓度X（μg/L）为横坐标，绘制基质标准曲线。

图1 10μg/L标准溶液在纯流动相及不同样品基质中响应值相对强度的比较

在3种样品基质中，阿维菌素B1a的浓度在5～100μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数大于0.998（见表2）。以信噪比（S/N）大于3确定检出限（LOD）为5 μg/kg，以S/N大于10且回收率和精密度较好的浓度点确定定量限（LOQ）为10μg/kg。图2为5 μg/L的阿维菌素B1a标准溶液色谱图。

图2 阿维菌素B1a标准溶液色谱图

表2 线性方程及相关系数

2.6 方法回收率和精密度

在阴性绿茶、小麦、丹参样品中分别添加10，50μg/kg两个水平的目标物进行回收试验，重复测定5次，方法的回收率和测定结果的相对标准偏差（RSD）见表3。

表3 回收率和精密度试验结果

2.7 样品测定

对企业送检的出口欧盟的茶叶及酿酒的原料小麦各测定50份，当地药店购买的不同产地的丹参样品测定10份，均未检出阿维菌素B1a残留。

3 结语

采用液相色谱-电喷雾串联质谱法建立了植物源产品茶叶、粮谷、中药材中阿维菌素B1a残留的测定方法。本方法采用微波辅助萃取，提高了复杂基质中目标物的提取效率；采用石墨化炭黑/氨基柱净化，有效除去了主要干扰物色素，净化效果较好。方法灵敏度好，回收率和精密度较稳定，适合复杂基质中阿维菌素B1a残留的确证和定量。

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Determ ination of Avermectin B1a Residues in Plant-originated Foodstuffs by M icrowave Assisted Extraction–Liquid Chromatography Tandem M ass Spectrometry

Jiang Hong
(Jiande Supervision Testing Center of Quality and Metrology,Jiande 311600, China)Hu Beizhen，Song Weihua
(Shaoxing Inspection and Quarantine Bureau, Shaoxing 312000，China)

A m icrowave assisted extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determ iantion of avermectin B1a residues in tea，cereals and Chinese herbal medicine was developed. The sample was extracted by m icrowave assisted extraction w ith acetone-dichloromethane(volume ratio was 1∶1) as solvent，the extract was cleaned up by Carb/NH2SPE column. The separation was performed on a Hypersil Gold C18column(150mm×2.1 mm，5 μm) and w ith the gradient elution of acetonitrile and water (containing 2.5 mmol/L ammonium acetate). Avermectin B1a was determ ined in the mode of electrospry positive ionization (ESI+) and multiple reaction monitoring(MRM). The quantification was carried out by matrix-matched external standard curve，the calibration curves showed good linearity in the concentration range of 5-100μg/L and the correlation coefficient was more than 0.998. The limit of detection(S/N ＞ 3) was 5 μg/kg and the lim it of quantification (S/N ＞ 10) was 10μg/kg. The recoveries in green tea，wheat and danshen samples at spiked levels of 10, 50μg/kg ranged from 75% to 87%，w ith the relative standard deviation of 4.04% - 6.38%(n=5). The method established has advantages in extraction and purification and is sensitive enough in meeting the requirements of maximum residue lim it (MRL) of avermectin B1a. The method is suitable for determ ination of avermectin B1a in plant-originated foodstuffs w ith complex matrix.

microwave assisted extraction; LC-MS-MS; plant-originated foodstuffs; avermectin B1a

O657.7

A

1008–6145(2012)02–0045–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.02.013

联系人：胡贝贞；E-mail: hubeizhen_002@yahoo.com.cn

2011-12-29