湖南郴州非综合征型聋患者GJB2、SLC26A4和线粒体DNA12SrRNA基因突变分析△

胡鹏 邓忠 谭东辉 赖若沙 朱发梅 谢鼎华

耳聋是造成人类残疾的最常见原因，目前我国有117万聋儿，其中7岁以下聋儿有80多万，约60%是遗传性聋[1]。70%的遗传性聋是非综合征型聋，不伴其它器官症状。国内大规模耳聋分子流行病学研究表明：缝隙连接蛋白2 (gap junction beta 2, GJB2)、溶质转运基因家族26类4号(solute carrier family 26 member 4, SLC26A4) 和线粒体DNA12SrRNA基因是最常见的3个非综合征型耳聋基因[1]。本研究采用耳聋基因芯片联合DNA测序法对湖南郴州地区154例非综合征型聋患者实施这3个基因的突变检测，探讨该基因芯片用于临床的适用性，并分析该地区非综合征型遗传性聋的分子流行病学特点。

1 资料与方法

1.1研究对象 本研究调查对象为2010年9月至2011年3月间就读于湖南郴州聋哑学校的学生及在中南大学湘雅二医院就诊的均诊断为非综合征型聋的患者154人，均为汉族，男85例，女69例，年龄3～14岁，平均7.8±3.6岁。来自中国郴州地区的154个家庭，在调查前得到患者家属的正式同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1临床资料采集 通过患儿家长填写问卷式调查表获取患儿的出生史、耳聋发病年龄、家族史、个人史(聋前传染病史、耳毒性药物应用情况、头部外伤史等)、母亲孕期情况等。对患者进行全身检查排除综合征型聋，同时进行耳科体检、听力检测及耳部影像学检查等，排除中耳炎和外伤等其他致聋因素。听力检测显示患者均为重度以上(听力损失大于61 dB)的双侧感音神经性聋。

1.2.2DNA提取 用含EDTA抗凝剂的真空采血管采集受检者外周血5 ml，应用试剂盒(北京天根生物工程有限公司)提取DNA，提取步骤参照试剂盒提供的使用说明进行。DNA经紫外分光光度计进行定量和纯度检测后，保存于-20 ℃备用。

1.2.3基因芯片检测 应用耳聋基因芯片(北京博奥生物有限公司)进行遗传性聋基因突变热点筛查，按试剂盒说明书进行操作。该芯片可检测国人中常见的4个耳聋基因中的9个热点突变，包括GJB2(35delG、176del16bp、235delC及299delAT)、GJB3(538C>T)、SLC26A4 (IVS7- 2A>G及2168A>G)和线粒体DNA12SrRNA(1494C>T及1555A>G)。

1.2.4GJB2基因序列检测 对基因芯片检测未发现GJB2基因突变和仅发现单个杂合突变的患者进行GJB2基因的测序。由于GJB2基因的蛋白编码序列仅存在于第2外显子上，采用文献报道的引物进行PCR扩增GJB2基因第2个外显子[2]，引物由南京金斯瑞生物公司合成。PCR反应体系为50 μl：DNA模板(20 mg/L)4 μl，正反向引物(100 mg/L)各2 μl，2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)25 μl，ddH2O加至50 μl。95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环，反应终止后再72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。经电泳检测产物特异性好的，送南京金斯瑞测序公司纯化及测序。

1.2.5SLC26A4基因序列检测 对基因芯片检测发现SLC26A4基因的IVS7-2A>G或2168A>G(H723R)突变的患者标本进行SLC26A4基因的测序。SLC26A4基因共21个外显子，其中开放阅读框共20个外显子，不包括第1号外显子。本研究采用文献中报道的引物进行PCR扩增及测序[2]，其中7、8外显子同在一个扩增子内，11、12外显子在一个扩增子内。共扩增18个片段以覆盖SLC26A4全部cDNA序列及每个外显子前后的剪切区序列。采用以下检测策略：先检测SLC26A4基因突变热点区域第7、8号外显子(扩增子包括第7、8号外显子以及两者之间的内含子)，还有第19外显子以验证基因芯片的准确性；如果发现纯合或复合杂合突变即停止检测，如果未发现突变或发现单杂合突变则先筛查第3、10、17、15号外显子，然后检测剩余外显子，直至发现另一个突变或检测完全部外显子。

PCR反应体系同GJB2基因序列检测。第7、8外显子反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环，反应终止后再72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。其它外显子反应条件同第7、8号外显子基本一致，只是复性温度为60 ℃。PCR产物送纯化后测序。

1.2.6序列分析 应用DNAStar软件包中的Seqman软件进行序列对比分析，将测序结果与Genebank的标准序列进行比对。

1.3统计学方法 采用SPSS 13.0软件包对基因芯片法和DNA测序法检测GJB2基因突变的检出率进行配对卡方检验(McNemar检验)。

2 结果

2.1基因芯片检测结果 基因芯片法共检出26例患者有GJB2基因突变，检出率为16.88%(26/154)，包括纯合突变9例(235delC纯合8例，299delAT纯合1例)，复合杂合突变10例(235delC+299delAT复合杂合9例，235delC+176del16复合杂合1例)，单纯杂合突变7例(235delC杂合3例，299delAT杂合4例)。另外检出10例(6.49%，10/154)SLC26A4基因突变，包括IVS7-2A>G杂合突变8例，H723R杂合突变2例。还检出3例患者线粒体DNA12SrRNA基因突变，检出率为1.95%(3/154)，包括1555A>G突变2例(1.30%)，1494C>T突变1例(0.65%)；这3例患者没有明确的耳毒性药物应用史，其中2例有母系遗传的家族史。所有患者未检出GJB3基因538C>T突变。

基因芯片法共确诊22例，其中，19例为GJB2基因突变导致遗传性聋(纯合突变9例和复合杂合突变10例)，3例为线粒体基因突变导致。SLC26A4基因突变的患者需进一步测序才能确诊。

2.2DNA测序结果 对基因芯片确诊的部分标本进行GJB2基因的PCR扩增和测序，符合率为100%。对基因芯片法未能确诊的患者标本进行基因测序，又发现GJB2纯合突变1例(109A>G纯合)，复合杂合突变1例(235delC+109A>G，本例已由基因芯片诊断为235delC单杂合突变)，单杂合突变7例(109G>A突变3例，139G>A突变1例，368C>A突变2例，439G>A突变1例)，其中2例(纯合突变1例，复合杂合突变1例)确诊为GJB2致聋。

两种方法共检测出34例患者有GJB2基因突变，突变检出率为22.08%(34/154)，其中纯合突变10例，复合杂合突变11例，单杂合突变13例；21例(13.64%，21/154)GJB2基因纯合或复合杂合突变确诊为GJB2基致聋，共检测出7种GJB2基因突变(235delC、299delAT、176del16、109G>A、139G>A、368C>A、439G>A)，均为文献及The connexin-deafness homepage已经报道的突变[3]，同时还检出3种文献报道过的多态(79G>A、341G>A、608T>C)[3,4]。GJB2基因检测结果见表1。

对基因芯片检出SLC26A4基因单杂合突变的10例标本进行PCR扩增及测序，在6例标本中检测出了该基因另一个突变，证实为复合杂合突变，检出率3.90%(6/154)，另外4例未检测出另一突变。这10例均行颞骨高分辨率CT(HRCT)或MRI检查，6例复合杂合突变者证实均为大前庭水管综合征，4例单纯杂合突变的患者中2人有前庭水管扩大，另2人未见异常。两种方法共发现7种SLC26A4基因突变， 其中 6 种为报道过的突变(S391R、T410M、IVS15+5G>A、IVS7-2A>G、T94I和H723R)[5,6]，另一种为新发现的突变Q696X，是第18号外显子2086位点的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶(2086C>T)，导致编码的696位上的谷氨酰胺改变为终止密码子(图1)。该突变的先证者为IVS7-2A>G和Q696X复合杂合突变，表现为前庭水管扩大伴极重度聋，其父母基因型分别为IVS7-2A>G和Q696X的单杂合子，听力正常。由于该突变与耳聋表型相关，而且对100例正常人DNA样本18号外显子进行PCR扩增并测序，未检测出相同突变，故认为Q696X是一个新的致聋突变而非多态。

在发现的10例SLC26A4基因突变者中，IVS7-2A>G所占的比例最高，达5.19%(8/154)，其次为H723R和T410M，各2例，检出率均为1.30%(2/154)。10例患者的临床表现和SLC26A4基因检测结果见表2。

表1 154例患者GJB2基因突变检测结果

图1 突变2086C>T(Q696X)正向测序图:左---野生型；右---突变型杂合子

表2 10例SLC26A4基因突变患者临床表现和基因型

2.3基因芯片法及DNA测序法测得的基因突变检出率比较 154例患者用基因芯片法检测GJB2基因突变的检出率为16.88%，DNA测序法的检出率为22.08%，两种方法检出率的差异无统计学意义(χ2=1.325，P=0.25)。

3 讨论

遗传性聋具有高度的基因异质性，与耳聋有关的基因多达200多种，给病因诊断带来很大困难。不过，中国人中最常见的GJB2、SLC26A4和线粒体12SrRNA 3种致聋基因都有突变热点，目前国内针对这些特点开发了遗传性耳聋基因芯片，并用其检测了大批患者[7]，本研究证实了该芯片的可靠性和实用性。

GJB2是发病率最高的遗传性聋致聋基因，在中国人遗传性聋患者中GJB2基因突变携带率约为21%[8]。本组对象中GJB2基因的突变率为22.08%，其中235delC是最常见的突变类型，与文献相吻合[9]。本组患者299delAT突变检出率仅次于235delC，说明109G>A突变也是本地区的另一个热点突变，可以考虑在基因芯片中增加该位点的检测。由于基因芯片快速、准确和低成本的优点，可用于GJB2基因的筛查，但由于基因芯片不能发现新的和少见的突变，还不能完全取代DNA测序。

SLC26A4基因型具有明显的种族特异性，在中国人大前庭水管综合征患者中最常见的SLC26A4基因突变类型是IVS7-2A>G，其次为H723R[12]。本研究应用基因芯片进行SLC26A4基因的快速筛查，发现IVS7-2A>G突变在本地区非综合征型聋患者中携带率为5.19%，H723R突变携带率为1.30%；2名大前庭水管征患者只检测出SLC26A4基因单个杂合突变，推测可能在患者基因的调控区或内含子区域有另一个突变；其余具有SLC26A4基因单纯杂合突变，但没有大前庭水管征表现的患者，则可能是由于其他原因致聋。

SLC26A4基因有21个外显子，对患者的所有外显子测序费时费力。根据中国人大前庭水管综合征患者中IVS7-2A>G和H723R两种突变高发的特点，本研究用基因芯片筛查这两种突变的携带者后，再进行SLC26A4基因测序和影像学检查确定是否为大前庭水管征患者。由于部分患者缺少这两种突变，因此基因芯片法有一定的漏诊率。

本研究共发现SLC26A4基因的7种突变，6种为报道过的突变(T94I、S391R、T410M、H723R、IVS7-2A>G和IVS15+5G>A)，分别位于SLC26A4基因的第3、10、19外显子和第7、15内含子上；IVS7-2A>G和IVS15+5G>A为剪接区突变，其突变使前体mRNA不能正常剪接，影响Pendrin的翻译。4种错义突变(T94I、S391R、T410M、和H723R)可导致编码的氨基酸改变，影响Pendrin的结构和功能[13]。本研究新发现的无义突变Q696X是第18号外显子2086位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，导致编码的696位上的谷氨酰胺改变为终止密码子，使蛋白质的翻译提前终止，推测其可导致Pendrin的结构和功能损害。这一新发现的突变对大前庭水管征的病因研究具有重要意义。

本次研究还检出3例患者线粒体DNA12SrRNA基因突变，包括1555A>G均质突变2例，1494C>T均质突变1例。这3例患者没有明确的耳毒性药物应用史，不过其中2例有母系遗传的家族史。1555A>G突变可以导致氨基糖苷类药物相关的感音神经性聋，氨基糖苷类药物致聋有两种情况：一是用药过量；二是正常用药或是仅用少量的药物就导致耳聋，即所谓“一针致聋”，后一类患者大多是线粒体基因突变的携带者[14]。1555A>G突变改变了人类线粒体小rRNA亚单位一个保守区域，增强了氨基糖苷类抗生素与线粒体核糖体的结合，破坏了线粒体蛋白质合成，减少ATP生成，导致毛细胞死亡。1555A>G是导致耳聋的最常见线粒体基因突变，据报道在中国人中的阳性率为1%～3%[14]。本研究在郴州地区非综合征型聋患者中1555A>G突变检出率为1.30%，与我国大部分地区的阳性率一致[8.12,15]。另一个药物敏感致聋靶点1494C>T突变的检出率为0.65%。对线粒体DNA12SrRNA基因突变的患者进行早期诊断，可以给其家族内的母系成员早期预防和干预，避免应用氨基糖苷类药物，降低药物性聋的发生率。

4 参考文献

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3 Cx26 mutation database: http://davinci.crg.es/deafness/

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