Wnt信号通路与内耳发育调控

陈志婷 综述 张小兵 审校

生物体细胞中有多条细胞信号通路，这些信号通路在生物的胚胎发育、器官形成、物质和能量代谢中起着关键作用。Wnt信号途径是一类进化上相对保守，在许多动物机体中(包括蝇类、虫类、鱼类、蛙类、小鼠及人类)对控制胚胎发育有重要作用的信号传导途径。目前研究显示，Wnt信号途径参与哺乳动物内耳发育过程，在内耳细胞的分化、特化方面作用突出。本文就Wnt信号途径参与内耳发育的调控机制及临床应用进行综述。

1 Wnt信号途径

1982年，Wnt基因首次在小鼠乳腺癌中被发现，由于此基因激活依赖小鼠乳腺癌相关病毒基因的插入，最初被命名为Int1癌基因。随着研究的进展，发现该基因在小鼠正常胚胎发育中起重要作用，相当于果蝇的无翅(Wingless)基因，可以控制胚胎轴向的正常发育。随后的研究显示Int1基因在神经系统胚胎发育中起重要作用，因此将Wingless和Int1结合，称为Wnt基因。Wnt信号途径由Wnt蛋白及其受体、调节蛋白等一起组成了复杂的信号通路，调控细胞分化、胚胎发育等多个重要过程。

1.1Wnt 信号分子 Wnt信号途径由Wnt信号蛋白与Frizzled跨膜受体蛋白结合，经过细胞内复杂的信号转导过程，将信号由细胞表面传到细胞核内。其主要成分包括Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜受体蛋白、Dishevelled(Dsh/Dvl)蛋白、β连环蛋白(β-catenin、β-cat)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、APC蛋白及TCF/LET家族转录调节因子。哺乳动物中，Wnt蛋白至少有19种[1]，人类细胞表达18种。该蛋白家族含有22～24个半胱氨酸残基的保守区域，与细胞表面及细胞外基质有联系，在细胞间起信使的作用。Wnt 受体为Frizzled家族蛋白及低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDL receptor related protein, LRP)，Wnt 通过Frizzled蛋白及LRP5和LRP6传递信号。完整的Frz蛋白结构胞外N端富含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain,CRD)，CRD结构是Frz配体连接位点，能与Wnt 结合。LRP6以Wnt依赖的方式与Frizzled相互作用。β-连环蛋白是一种细胞骨架蛋白，是Wnt信号通路中关键的调节因子，其稳定性及在细胞内的位置受到一系列正性调节因子和负性调节因子的调控，其功能调控异常可以导致 Wnt信号通路的异常激活，从而产生基因表达、细胞粘连、发育等一系列异常。APC基因定位于染色体5q21-22，其蛋白产物位于胞质内。最近发现APC蛋白可与α-及β-catenin连接，而后两者是细胞黏附因子-E钙粘蛋白的细胞内配体，在细胞黏附中发挥作用[2]。同时，APC蛋白羧基端可以与细胞微管相连接，因此，APC蛋白可能通过调控β-catenin与微管间信号传递，对细胞的运动、黏附及细胞内外信息交流发生影响，继而调节细胞的生长与分化。

1.2Wnt信号的调控 Wnt是一类分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌等方式发挥作用。Wnt 信号途径激活过程为：Wnt 蛋白与其Frizzled受体蛋白结合后，将信号传导到Dishevelled (Dsh)，后者被激活，接着激活zw3/GSK3，导致细胞内的β-cat水平升高，后者进入细胞核内，通过与TCF结合，激活靶基因的转录。Wnt信号在细胞生长和分化以及多种人类疾病的病理过程中发挥重要作用。Wnt通路的胞内信号可分为4个分支(图1)[3]：① 典型的Wnt/ β-catenin信号通路(Canonical Wnt/β-catenin pathway)，此通路激活核内靶基因的表达；② 平面细胞极性通路(the planar cell polarity pathway)，此通路参与JNK的激活及细胞骨架的重排[4～6]；③ Wnt/Ca2+通道，激活磷脂酶C(PLC)和蛋白激酶C(PKC)[7，8]；④ 调节纺锤体的方向和非对称细胞分裂的胞内通路。细胞内不同信号的选择取决于受体Frizzled蛋白家族的特性。

图1 Wnt的4条信号通路[3]

Wnt蛋白与细胞表面的相关受体结合是传递细胞间信号的第一步[9]，一般认为，依赖β-catenin的信号通路是Wnt蛋白激活细胞间信号通路的主要途径[3]。在该通路中，酪蛋白激酶1α(CK1α)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化轴蛋白复合体中的β-catenin，磷酸化的β-catenin泛素化，导致β-catenin下调，引起细胞质内的β-catenin处于低水平[10～12]。当Wnt蛋白与细胞表面Frizzled受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)结合时，轴蛋白复合体中的β-catenin上调[1]。

2 Wnt信号与生物体的发育

Wnt信号参与肿瘤的形成。Wnt信号通路在乳腺癌、原发性肝癌等肿瘤的形成中表现异常，最近在多种肿瘤中频繁的检测出Wnt通路下游分子发生突变和缺失。

Wnt信号途径参与器官发生。鼠胚胎实验研究显示，在Wnt3a-/-鼠胚胎，大脑皮质尾部中段增生性扩展缺陷而使大脑海马回发育受损，提示Wnt参与海马回的发育，同时，表达Wnt1的细胞如果条件性地缺失β-catenin基因，则使中脑和大脑的发育严重受损，因此认为Wnt信号在脊椎动物神经系统形成过程中发挥关键作用[13]。另外，Wnt1和Wnt3a影响神经嵴的分化,可以在细胞发育过程中改变细胞的命运[14]，因此认为Wnt信号通路参与决定神经嵴细胞发育的多样性[15]。

Wnt信号参与胚胎体轴和中胚层模式的建立。实验证实，爪蟾和斑马鱼体轴的形成需要β-catenin以及Wnt/β-catenin通路的其他信号分子的参与[16]。小鼠胚胎发育的研究也证实，β-catenin在小鼠胚胎发育过程中前后轴的形成和中胚层的诱导发挥极其重要的作用[17]。

Wnt/β-catenin信号通路参与细胞特化和干细胞的分化。研究还证实，肠细胞、脂肪细胞、造血细胞的分化也需要Wnt信号通路参与调控。在人类造血系统中，Wnt蛋白家族的产物作用于血细胞生长因子，并在血细胞早期前体细胞中表现出高度特异性[18，19]。目前，随着各学科研究的发展，Wnt信号通路在生物体涉及到的组织形成、组织极化以及细胞最后的特化正逐步被证实。

3 Wnt信号通路与内耳发育

所有成熟的内耳结构都源于听囊(一个位于后脑两侧的囊样上皮样组织[20])。在脊椎动物中，前庭主要发育于背侧听囊，而耳蜗则主要来自听囊的腹侧区[21]。从听板到听囊到内耳发育成熟，组织形态形成和细胞特化紧密协调，贯穿于整个过程中。有几十种基因在时间、空间上精细、准确地差异表达，并以此决定各感觉器官、感觉上皮的分化发育方向。Wnt相关基因的表达伴随着一系列内耳发育过程，如细胞分化、区域性的耳蜗管趋向延伸、突触的发生以及平面细胞极性的建立等。可见，Wnt信号途径作为关键性调控通路参与内耳发育。

3.1Wnt信号与听基板的发育 研究表明，所有的颅面部感觉器官(包括内耳)在发育早期都来源于一个共同的“前板样区域”。Wnt信号参与决定耳板和上皮之间的细胞分化[22]，耳板向内耳的发育有赖于周围组织细胞分子信号的作用，如中胚层和后脑。在爪蟾耳板发育的研究中发现，神经板上一个单独的区域与随后发育而成的前后脑的部分区域相对应，该区域中存在诱导Pax-8的活动，谱系追踪实验发现源自后脑的刺激信号促使耳板向耳泡的发育[23]。对背侧耳泡标记物Dlx5和Dbx2以及内淋巴管标记物Msx1的研究显示，Wnt信号途径不仅参与决定Pax2+前体细胞向耳板的发育，而且参与了耳上皮背侧细胞的发育分化[24]。

3.2Wnt信号与听囊的形成 Liu等[25]研究发现，外源性的Wnt5a在富含耳周间叶细胞和耳上皮细胞的培养基中可以诱导耳囊软骨形成，而分泌型Frizzled相关蛋白3(sfrp3)则抑制内源性的Wnt5a对耳囊软骨发育的正性作用，表明Wnt5a和sfrp3是大鼠内耳耳囊发育的关键调节因子。内耳发育分别沿着其背侧/腹侧轴分化为前庭器官和听觉器官。而腹侧听囊的分化依赖于脊索分泌的Shh蛋白，来自于背侧后脑的Wnt信号作用于背侧听囊发育[26，27]。

3.3Wnt信号与内耳上皮细胞发育 哺乳动物中，位于感觉上皮组织的机械感应性毛细胞静纤毛束的发育是单向性的。研究表明，Wnt信号调节毛细胞静纤毛束的单向性发育。体外培养发现，Wnt7a蛋白或者Wnt信号途径抑制因子(分泌型Frizzled相关蛋白1)以及Wnt抑制因子1干扰纤毛束的发育。并且，Wnt7a蛋白表达模式与其在正在发育的毛细胞静纤毛束的干扰作用是一致的。由此得出，贯穿于发育外毛细胞区域的Wnt信号通路在哺乳动物的耳蜗中产生平面极性，参与内耳毛细胞发育[28，29]。有实验表明，毛细胞的机械损伤可以使连接毛细胞及其周围支持细胞的跨膜糖蛋白之间的内聚力分开，随后，这一信号将促使毛细胞开始分裂再生，直到重新建立相互间的连接。由于Wnt信号途径中众多的分子参与到细胞间的粘附过程，可以推测，Wnt信号通路参与了毛细胞机械损伤后的再生机制。β-catenin在小鼠耳上皮细胞表达，随着增殖细胞的减少，β-catenin表达的强度和范围也减少；另外，在毛细胞分化和成熟阶段，β-catenin表达的范围进一步减少，可见，β-catenin的表达与耳上皮细胞的发育、发展相关[30]。Stevens等[31]研究发现，逆转录病毒介导的Wnt3a的错误表达使耳蜗管中出现异位前庭斑。同时，用原位杂交技术研究得出三个Frizzled受体基因c-Fz1、c-Fz7和c-Fz10,在感觉原始细胞内和邻近区域表达, 而Wnt4则表达于耳蜗管的非感觉区域附近。所以可以认为，Wnt/β-catenin信号通路参与耳上皮特化以及内耳感觉区域和非感觉区域的形成和维持过程。

3.4其他 Daudet等[32]研究发现在出生后大鼠耳蜗中存在Wnt基因家族(RWnt-2b、-4、-5a、-5b、-7a)和Frizzled 基因家族(Rfz 1、Rfz2、Rfz3、Rfz4、Rfz6、Rfz9)的表达，RWnt-4、-5b、 -7a在未成熟的大鼠耳蜗中有不同的表达模式，且有部分重叠，说明Wnt-Frizzled信号通路可能在后期耳蜗的分化和/或听功能建立方面发挥作用。Wnt途径的配体Norrin，是一个含有半胱氨酸结构基序的分泌型蛋白，在耳血管发育中起关键作用。Coiled-coil-DIX1 (Ccd1) 基因与Dishevelled和Axin形成复合体，正性调节Wnt/β-catenin通路，原位杂交实验发现该基因表达于神经系统的所有神经细胞，与神经嵴源性组织密切相关[33]。

4 Wnt基因家族临床应用

随着相关学科的不断深入，参与内耳发育的调控信号机制不断被揭示，为内耳疾病的治疗提供了分子生物学水平的证据和方法。如，Notch信号通路中的Math1基因是内耳发育的重要因子，可以使受药物损伤的毛细胞再生，已被用于进行内耳基因治疗的研究。Notch信号通路在内耳发育的研究日趋成熟，为Wnt相关基因在内耳发育过程作用的更深入研究提供了方向，如内耳细胞分化、区域性的耳蜗管趋向延伸、突触的发生以及平面细胞极性的建立等，也为该基因家族成员应用到基因治疗的研究提供了方法。

人工耳蜗植入是目前感音神经性聋的治疗方法之一，然而，现在仍然存在诸多需要解决的问题，其中之一便是患者较难在嘈杂的环境中分辨声音以及韵律或者听音乐[34]，主要原因之一便是植入到鼓阶的电极和螺旋神经节的包体之间距离过远。通过诱导神经细胞轴突生长等手段最小化这两者之间的距离使得周围组织对电极的干扰降低，可以明显的改善植入者的听力[35]。

感音神经性聋患者螺旋神经节和Corti器之间的神经轴突退化。近年来研究发现成年鼠螺旋神经节具备再生轴突的能力并且至少在耳蜗区域具有诱发再生的信号因子[36～39]。Shah等[40]研究发现，Wnts蛋白可以在耳蜗中提供诱导信号，因为他们富含诱导信号可以结合的区域：19个配体,10个frizzled同源受体(Fzd)和受体样酪氨酸激酶(Ryk)以及四个不同的跨膜信号途径，研究人员检测了老年性聋大鼠的整组基因序列，并用原位杂交实验证实， Wnt受体frizzled 1、4、6、9、10 mRNA明确出现在成年大鼠螺旋神经节处；同时，在体外培养的螺旋神经节再生出神经轴的区域，观测到了frizzled 9蛋白。以上实验可以初步认定Wnt信号通路在神经性聋的哺乳动物内耳诱导神经突触生长过程中起到重要作用。

5 展望

随着细胞分子生物学技术的发展，越来越多的与内耳发育相关的新基因被发现，使我们能更好地了解内耳发育各阶段的基因表达模式。但是Wnt信号通路对内耳发育的具体作用机制目前尚不是很清楚。从分子水平了解内耳的发育机制是寻求听力障碍治疗方法的基础，已成为本学科专业研究的重点，更全面地了解内耳发育过程中感觉上皮细胞增殖、定向分化及其分子机制，有助于深入研究毛细胞的再生机制，并为神经性聋提供一种更有效的治疗方法。

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