腺病毒介导的碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脊髓损伤腹后外侧索少突胶质细胞的影响

杨彦玲

延安大学医学院生理教研室，陕西延安 716000

腺病毒介导的碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脊髓损伤腹后外侧索少突胶质细胞的影响

杨彦玲

延安大学医学院生理教研室，陕西延安 716000

目的观察腺病毒 (Adts)介导碱性成纤维细胞生长因子 (FGF-2)对大鼠脊髓损伤腹后外侧索少突胶质细胞的影响。方法32只SD大鼠在T10水平制备脊髓损伤模型，随机分为体内转基因治疗组和损伤对照组，用携带FGF-2和绿色荧光蛋白 (GFP)的Adts行直接体内转基因治疗。荧光显微镜观察体内转基因表达，斜板实验检测大鼠运动功能恢复情况，免疫组织化学染色观察腹后外侧索少突胶质细胞 (CC1+)数量的变化。结果荧光显微镜观察发现，Adts载体直接引入脊髓后可有效感染脊髓组织并表达报告基因。斜板实验检测结果显示，体内转基因治疗组大鼠的倾斜平面角度明显高于对照组 (P＜0.05或P＜0.01)。免疫组织化学结果证实，腹后外侧索CC1+数量较对照组明显增加 (P＜0.05)。结论Adts介导的FGF-2可促进少突胶质细胞的存活和增殖。

脊髓损伤;碱性成纤维细胞生长因子;少突胶质细胞;腺病毒载体;基因治疗

脊髓损伤是中枢神经系统的严重创伤，因其高致残率和高病死率一直成为医学研究的热门课题。碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor，FGF-2)对细胞有强烈的促进增殖和有丝分裂作用，对脊髓损伤的再生和修复具有重要作用，并且在脊髓损伤早期所起作用更为显著［1-3］。针对FGF-2在脊髓损伤后对神经元保护的可能机制，学术界提出了不同观点，如:FGF-2稳定细胞钙离子水平，抑制脊髓损伤区细胞凋亡，抑制c-fos基因的表达，抑制一氧化氮 (NO)的毒性，降低自由基形成，对抗兴奋性氨基酸的神经毒性作用，调节神经胶质细胞的反应等［4-6］。近年来，一些学者强调了少突胶质细胞 (CC1+)在脊髓损伤后的作用［6-7］。FGF-2可能参与了脊髓损伤后CC1+存活的调节，但是FGF-2如何调控损伤脊髓内CC1+的存活、分化和增殖，以及CC1+数量增加和运动功能的恢复是否有关，这些问题有必要进行深入研究。本研究通过腺病毒 (adenoviruses，Adts)介导将FGF-2基因转染至脊髓损伤局部，观察了FGF-2基因在体内的表达及对脊髓损伤后神经功能恢复的影响及其可能机制。

材料和方法

实验分组 雌性成年SD大鼠32只，体重200～220 g，随机分为4组 (n=8):(1)FGF-2-Adts高滴度组 (1.27×107pfu/rat);(2)FGF-2-Adts中等滴度组 (6.37×106pfu/rat);(3)FGF-2-Adts低滴度组(3.18×106pfu/rat);(4)绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)-Adts组 (5.9×107pfu/rat)。所用载体是携带小鼠FGF-2 cDNA表达片段的复制缺陷型重组腺病毒，由Doc.Smith(美国肯塔基州大学)惠赠。大鼠术后死亡2只，随后补充。分笼饲养，自由摄食及饮水，室温25℃。

脊髓损伤模型的制备 SD大鼠用80 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪进行腹腔麻醉，角膜上涂人工眼泪以保持眼睛湿润，防止角膜干燥。大鼠取俯卧位，背部剃毛备皮，酒精碘酒消毒，铺一次性无菌单。以T10棘突为中心作长约3 cm切口暴露硬脊膜。用美国PSI公司生产的脊髓打击器制备脊髓急性打击伤动物模型，以损伤力度200 kdynes/cm2(2×10-3N)造成大鼠脊髓不完全损伤，致伤后迅速移开打击物。模型成功的判定标准:打击后损伤处脊髓出血、水肿，大鼠出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩样扑动，麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。

腺病毒载体转染脊髓方法 损伤完成后迅速利用纳升微量注射器和微电极推进器在损伤部位尾端左侧和右侧注射不同滴度的FGF-2-Adts和GFP-Adts。微注射器插入脊髓组织0.6 mm，每次注射50 nl，共10次，注射完后，让毛细玻璃管在组织中继续停留2 min，使病毒均匀扩散开来。左侧完成后，以同样方法进行右侧，共注射1 μl病毒。用无菌生理盐水冲洗伤口后，以可吸收肠线缝合肌层，伤口夹子钳夹皮层。术后护理包括皮下注射33.3 mg/kg头孢唑啉注射液和20 ml Ringer's液，每天2次，持续3～5 d。每日膀胱按摩2次至大鼠自主排尿反射建立。电热毯加热，分笼饲养，自由取食，每天更换1次垫料保持干燥。2周后以乙醚麻醉大鼠，去掉伤口夹子。

取材 采取心脏灌注固定法，在戊巴比妥钠150 mg/kg深度麻醉下开胸，经左心室插管至升主动脉，剪开右心耳，先用4℃ 0.1 mol/L的PBS液快速灌注5 min。再以4℃ 4%多聚甲醛溶液灌注约200 ml，持续15 min。灌注完毕立即再次打开脊髓，取脊髓组织3 cm(以损伤为中心上下各1.5 cm)，多聚甲醛溶液固定4～6 h。0.2 mol/L PBS过夜，20%蔗糖溶液固定24～48 h，包埋，做连续冰冻切片，片厚约20 μm，-20℃冷冻备用。

运动功能评估 采用改良 Rivlin方法［8］，即在一长方形木制板上垫2 mm的橡胶垫，板可绕下边旋转。将大鼠头向前，身体纵轴与斜面板纵轴垂直放置，逐渐增大木板与水平面间的角度，直至大鼠在原定位置上刚好可以维持5 s，这一角度即为倾斜平面临界角度。在大鼠伤后1、4 d及1、2、3、4周分别测定倾斜平面临界角度。每只动物测5次，取其平均值作为测定值。

免疫组织化学染色 在常温下用含3%山羊血清、0.3%triton-X(TTX)和1%BSA的0.1 mol/L PBS孵育1 h后，加CC1+APC单克隆抗体 (Ab-7;Calbiochem，EMD Biosciences，San Diego，CA，10 g/ml)，4℃过夜。第2天以0.1 mol/L PBS洗片10 min×3次后，加入1∶200稀释的山羊抗兔抗体，4℃过夜。第3天0.1 mol/L PBS洗片10 min×3次后，加入1∶300稀释的链亲合素异硫氰酸荧光素 (streptavidin-FITC)，3 h避光，0.1 mol/L PBS洗片10 min×3次，盖玻片封胶。

统计学处理 采用StatView 4.5.3统计软件包，计量资料用F检验，计数资料用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

转基因检测结果 倒置荧光显微镜下观察发现，注射局部灰质和白质的胶质细胞内均有GFP表达，在病毒注射部位及临近的部位，尤其在距离注射部位3～4 mm范围内有较多的体内细胞表达GFP，距离注射部位越远，表达GFP的细胞越少，但在距离注射部位7～8 mm的脊髓内仍可见表达GFP的细胞(图1)。

图1 脊髓损伤后GFP表达的分布情况 (×100)Fig 1 Distribution of GFP-Adts expression after spinal cord injury(×100)

斜板实验检测结果 脊髓损伤1 d，各组动物的临界角度降至最低点，约为25°;伤后4 d内，治疗组和对照组的倾斜平面临界角度值差异无统计学意义 (P＞0.05);伤后1周，FGF-2组大鼠的倾斜平面临界角度值较GFP对照组上升更为明显，两组差异有统计学意义 (P＜0.05);伤后2～4周，各组大鼠的临界角度均有部分回升，但FGF-2治疗组较GFP对照组回升的幅度更大 (P＜0.01)(表1)。

腹后外侧索CC1+的数量变化 荧光显微镜下可见CC1+细胞核为免疫阳性染色，呈蓝色，FGF-2组CC1+大量增殖，细胞密度明显增大 (图2)。三维细胞计数腹后外侧索CC1+显示，FGF-2高、中、低滴度组的 CC1+数量分别为 (648 000±30 000)、(752 000±32 000)、(644 000±28 000)个，均明显高于GFP对照组的 (532 000±26 000)个 (P均＜0.05)，中滴度组的CC1+数量与低滴度组、高滴度组相比差异也有统计学意义 (P均＜0.05)。

表1 脊髓损伤后大鼠倾斜平面临界角度变化 (n=8，± s，°)Table 1 Changes of the maximal angles of inclined plane after severe spinal cord injury(n=8，± s，°)

表1 脊髓损伤后大鼠倾斜平面临界角度变化 (n=8，± s，°)Table 1 Changes of the maximal angles of inclined plane after severe spinal cord injury(n=8，± s，°)

与GFP对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01aP＜0.05，bP ＜0.01 compared with GFP control group

分组Group Days after injury 1 d 4 d 1周1 week 2周2 weeks 3周3 weeks 4周损伤后的时间4 weeks绿色荧光蛋白组GFP group低滴度FGF-2组FGF-2-low中滴度FGF-2组FGF-2-medium高滴度FGF-2组FGF-2-high 25.1±2.6 26.6±2.6 25.6±2.7 27.6±2.4 26.4±2.6 28.4±2.2 27.4±2.4 29.4±2.7 29.4±3.4 38.4±3.2a 39.4±3.6a 43.4±3.5a 35.4±3.2 45.4±3.2b 46.4±3.7b 48.4±3.8b 39.4±3.5 48.4±3.2b 49.4±3.6b 52.4±3.5b 42.4±3.6 50.4±3.4b 51.4±3.8b 54.4±3.9b

图2 腹后外侧索的少突胶质细胞的表达Fig 2 Over-expression of oligodendrocytes in the ventral lateral funiculi

讨 论

FGF-2是一种对神经细胞的生长、发育、分化及再生起重要调节作用的蛋白质，对细胞有强烈的促进增殖和有丝分裂作用［2］。Rabchevsky等［9］选用蛛网膜下腔置管、微量泵连续l周给予外源性FGF-2的干预方法研究脊髓损伤大鼠，通过6周的观察发现，大鼠运动功能有明显恢复，说明外源性FGF-2对脊髓损伤大鼠神经功能的恢复有确切作用。Meijs等［10］在行雪旺氏细胞移植治疗胸髓横断伤时发现，给予外源性FGF-2者损伤周围轴突的再生情况比未给予外源性FGF-2者明显要好，说明外源性FGF-2可促进脊髓损伤后轴突的再生。这些研究表明FGF-2可以保护脊髓神经组织、促进神经纤维再生。

由于脊髓损伤需长时间提供神经营养因子，通过局部或全身给予外源性FGF-2均难以达到理想的治疗效果，而转基因技术的发展使其发挥长期、高效的作用成为可能。Adts载体具有宿主范围广、增殖和非增殖细胞都能够转染和表达、病毒基因组不整合入宿主染色体内、病毒滴度高、外源基因表达水平高、插入容量大等优点，是一种理想的中枢神经系统基因治疗载体。本研究通过转基因技术把FGF-2基因移植到动物体内以足量分泌FGF-2因子，改善脊髓损伤微环境，对神经元起支持和保护作用。

直接将载体引入靶组织的注射法是一种切实可靠的简便方法。Zhang等［11］采用的注射剂量约为0.5 μl，本研究的剂量稍大，结果证明单纯注射本身引起的创伤对下肢功能没有明显损害。后期的观察未发现功能障碍，表明重组腺病毒所引起的局部反应也未造成功能损害。作为转基因治疗脊髓损伤的初步研究，本研究利用复制缺陷腺病毒载体将外源性FGF-2基因直接引入脊髓，证实该载体可有效地感染脊髓组织和表达报告基因。

本实验室的前期工作已经表明，将FGF-2基因直接转染至损伤部位，治疗组脊髓损伤组织的体积明显减小而脊髓灰质残存组织的体积明显增加，与对照组相比有显著差别，说明FGF-2能减少脊髓损伤后的坏死和萎缩，由此说明Adts介导FGF-2体内转基因治疗创伤性脊髓损伤的方法是可行的，且由Adts介导FGF-2的直接体内转基因治疗能够明显促进损伤脊髓的功能恢复［12］。本研究结果显示，将FGF-2基因直接转染至损伤部位，发现1～4周脊髓损伤大鼠的后肢运动功能评分较GFP对照组明显增高，腹后外侧索CC1+数量明显增加，与对照组相比差异有统计学意义。提示FGF-2能够明显改善大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复，运动功能的恢复与提高腹后外侧索CC1+的数量有关。由Adts介导FGF-2的直接体内转基因治疗能够明显促进脊髓损伤的功能恢复，其原因可能是:促进少突胶质前体细胞和少突胶质细胞的存活和增殖，改善损伤脊髓轴突髓鞘化;同时调节神经元和少突胶质细胞之间的相互作用从而促进中枢神经内轴突的再生，促进脊髓神经功能的恢复。

(志谢:感谢美国肯塔基州大学脑脊髓损伤中心Alexander Rabchevsky教授对本工作的指导)

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Effect of Adenovirus-mediated Basic Fibroblast Growth Factor Gene Transfer in vivo on Oligodendrocyte Cell Numbers Throughout Ventrolateral White Matter Following Spinal Cord Injury in Rats

YANG Yan-ling

Department of Physiology，Medical College of Yan'an University，Yan'an，Shaanxi 716000，China

YANG Yan-ling Tel:0911-2418889，E-mail:yangyanling8889@163.com

ObjectiveTo study the effect of adenovirus-mediated basic fibroblast growth factor(FGF-2)gene transferin vivoon oligodendrocyte cell numbers throughout ventrolateral white matter following spinal cord injury in rats.MethodsThirty-two adult female Sprague Dawley rats were injured with the Infinite Horizon Impactor，and then were randomly assigned to four groups:FGF-2-Adts high-titer group(1.27 ×107pfu/rat)，FGF-2-Adts intermediate-titre group(6.37×106pfu/rat)，FGF-2-Adts low-titer group(3.18×106pfu/rat)，and green fluorescent protein(GFP)-Adts group(5.9×107pfu/rat).The transgenic expressionin vivowas detected with fluorescence microscopy.The locomotor function of the hindlimbs of rats was evaluated using Rivlin plate.Slides mounted with tissue sections were processed for immunohistochemical detection and quantification of oligodendrocytes(CC1+)in the ventral lateral funiculi(VLF)of injured spinal cords.ResultsOne week after spinal cord injury，GFP showed that many cells had expressed objective genein vivoand the anglesof the occlusal plane of rats in FGF-2 groups were significantly higher than in GFP-Adts group.Also，there was a significant difference among the FGF-2-Adts treatment groups for the volume of gray matter sparing.However，there were no significant differences for total white matter sparing.Stereological quantification of total CC1+cell numbers in the spared VLF showed a significant reduction in numbers with GFP controls compared to all other groups 4 weeks after injury.In contrast，the FGF-2 Adts intermediate-titer group had significantly more CC1+cells when compared to both the FGF-2-Adts high-and low-titer groups.ConclusionAdenovirus-mediated FGF-2 gene transfer can promote the functional recovery of the injured spinal cord by enhancing the proliferation and/or differentiation of oligodendrocytes.

spinal cord injury;basic fibroblast growth factor;oligodendrocyte cell;adenoviruses vector;gene therapy

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):348-352

杨彦玲 电话:0911-2418889，电子邮件:yangyanling8889@163.com

R744

A

1000-503X(2012)04-0348-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.007

陕西省教育厅科学研究项目计划 (12JK0705)Supported by the Scientific Research Program for the Education Department in Shaanxi Province(12JK0705)

2012-04-11)

·论 著·