糖尿病肾病肾组织足细胞损伤与葡萄糖调节蛋白78表达及蛋白尿间的相关性

刘迎九，文煜冰，陶建瓴，李金红，苏 颖，叶 葳，李 航，李雪梅，李学旺

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院肾内科，北京 100730

糖尿病肾病肾组织足细胞损伤与葡萄糖调节蛋白78表达及蛋白尿间的相关性

刘迎九，文煜冰，陶建瓴，李金红，苏 颖，叶 葳，李 航，李雪梅，李学旺

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院肾内科，北京 100730

目的研究糖尿病肾病 (DN)患者肾组织足细胞损伤和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及尿蛋白量之间的关系。方法回顾性分析48例经肾活检确诊为DN患者的临床资料，根据尿蛋白量将患者分为＞3.5 g/d组 (n=31)和＜3.5 g/d组 (n=17)。对肾组织行威廉姆斯肿瘤蛋白-1(WT-1)免疫组织化学染色，冰冻肾组织行synaptopodin、GRP78免疫荧光双染色，在激光共聚焦显微镜下观察。结果尿蛋白量＞3.5 g/d组的足细胞密度为0.10个/μm2，明显低于尿蛋白量＜3.5 g/d组的0.15个/μm2(P=0.003)，足细胞密度与尿蛋白量呈负显著相关 (P=0.005)。肾小球Synaptopodin及GRP78表达呈线样或颗粒状沿基底膜排列，尿蛋白量与synaptopodin(P=0.004)和GRP78(P=0.001)表达具有显著负相关。结论随着尿蛋白量增加，DN患者的足细胞损伤程度随之加重，伴有内质网应激适应性调节能力下降。

足细胞;糖尿病肾病;synaptopodin;葡萄糖调节蛋白78

糖尿病肾病 (diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的微血管并发症，以大量蛋白尿及弥漫肾小球硬化为主要表现。DN是引起终末期肾衰竭的重要原因［1］。有研究表明，在DN发病过程中，足细胞数目明显减少，且减少的程度与蛋白尿量呈正相关，足细胞数目越少，患者进展至终末期肾衰竭的速度越快［2］。研究发现，内质网应激是细胞的一种适应性反应［3］，细胞在受到外界刺激时内质网会通过增加蛋白质的降解和运输来增强细胞对有害刺激的抵抗能力。葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)是一种内质网应激分子伴侣，其表达在一定程度上可反映内质网对应激调节的强度。有研究显示，在微小病变肾病动物模型上发现GRP78表达升高，并且伴大量蛋白尿，初步证实内质网应激与蛋白尿存在一定的关系，随后在多种肾病患者肾组织中检测到GRP78表达升高，但是在DN患者肾组织上还没有进行过此类研究。synaptopodin是足细胞的特异性骨架蛋白，主要表达在细胞膜上，威廉姆斯肿瘤蛋白-1(Wilms tumor-1，WT-1)是足细胞核蛋白，主要表达在细胞核，通过对这两者的观察可以间接了解足细胞的损伤情况。目前针对DN的研究主要集中在对DN早期发病机制的探索上，而有研究表明内质网应激在多种疾病致足细胞损伤中发挥一定作用［4］。刘志红等［5］以 WT-1标记足细胞，在DN患者足细胞上观察到随着尿蛋白量增加WT-1表达减少，足细胞数量也随之减少。但在DN患者中，并没有研究证明内质网应激在足细胞损伤中是否起到一定作用。本研究评估了DN患者不同尿蛋白量与足细胞损伤及GRP78表达之间的关系，初步探讨了内质网应激与足细胞损伤及蛋白尿量的相关性。

对象和方法

对象及分组 2001年1月至2011年1月在北京协和医院肾内科住院、行超声引导下经皮肾穿刺活检病理诊断为DN的患者48例，其中，男24例，女24例，平均年龄 (45.4±11.2)岁;高血压34例，贫血20例，血脂异常20例;肾小球弥漫硬化型22例，结节硬化型26例。排除各种原发性肾小球疾病、狼疮性肾炎、乙肝病毒相关性肾炎、肿瘤相关性肾病等其他继发性肾小球肾炎。根据尿蛋白量不同，将患者分为尿蛋白量＞3.5 g/d(n=31)和尿蛋白量＜3.5 g/d(n=17)两组。

临床资料收集 收集患者的年龄、性别、糖尿病病程、空腹血糖、餐后血糖、糖化血红蛋白、血脂、白蛋白、血肌酐、24 h尿蛋白等临床资料。

免疫组织化学染色 肾组织用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，制成5 μm石蜡切片，脱蜡水化后，以3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶15 min，微波98℃热处理25 min修复抗原，山羊血清封闭非特异性抗原，加入兔抗鼠WT-1(美国Santa Cruz公司，体积比1∶100)多克隆抗体，4℃孵育过夜标记足细胞核。PBS冲洗，加入生物素化二抗 (北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温下孵育30 min，PBS冲洗，滴加DAB显色液，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。以PBS代替一抗做为阴性对照，棕褐色为阳性着色。采用病理图像分析软件Image Pro-Plus(IPP)6.0半定量分析，每个切片随机选取5个肾小球［5］，计数WT-1染色阳性的足细胞个数及染色阳性面积/肾小球面积比。

免疫荧光染色 采用DN患者肾组织冰冻切片，厚度3 μm，滴加稀释度1∶20(体积比)鼠抗人标记的synaptopodin多克隆抗体 (美国Santa Cruz公司)，4℃孵育过夜，PBS冲洗，避光操作，滴加稀释度1∶100(体积比)异硫氰酸荧光素 (FITC)绿色荧光(美国Santa Cruz公司)标记的二抗，37℃孵育1 h，PBS冲洗，滴加1∶50(体积比)兔抗人标记的GRP78多克隆抗体 (美国Santa Cruz公司)，4℃孵育过夜，PBS冲洗，滴加1∶100(体积比)罗丹明荧光素 (TRITC)红色荧光 (北京中杉金桥生物技术有限公司)，37℃孵育1 h，PBS冲洗，滴加10 μl抗荧光淬灭剂，封片，激光共聚焦显微镜 (Leica SP2)下观察。

半定量分析 采用IPP多功能病理图像分析软件分析所有免疫组织化学及免疫荧光染色切片，在单盲情况下逐一在显微镜下摄片，并将肾小球图像采集入计算机，每例切片平均选取5个肾小球［6］，测定synaptopodin及GRP78阳性表达面积，对不同尿蛋白量患者组间进行比较，观察其相关性。

统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，组间计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用卡方检验，Pearson法分析相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

两组患者一般情况的比较 尿蛋白量＞3.5 g/d组和＜3.5 g/d组患者在男女性别比 (17/14比7/10，P=0.790)、年龄［(44.7±11.0)岁比(47.1±12.1)岁，P=0.594］、体重指数 ［(26.04±3.79)kg/m2比(24.11±2.41)kg/m2，P=0.089］、糖尿病病程［(109.9±75.6)个月比 (112.9±70.0)个月，P=1.000］、空腹血糖 ［(8.34±2.67)mmol/L比(7.73±2.13)mmol/L，P=0.357］、餐后血糖［(12.09±3.41)mmol/L比 (13.05±4.02)mmol/L，P=0.450］，糖化血红蛋白 ［(7.50±1.75)%比(7.71±1.32)%，P=0.379］、舒张压 ［(90.28±15.66)mmHg比(84.81±11.51)mmHg，P=0.213，1 mmHg=0.133 kPa］、总胆固醇 ［(7.71±2.93)mmol/L比(5.39±1.37)mmol/L，P=0.006］、高密度脂蛋白胆固醇 ［(1.40±0.45)mmol/L比(1.27±0.48)mmol/L，P=0.699］、血尿素氮［(17.43±11.41)mmol/L比(20.92±11.79)mmol/L，P=0.850］和血清白蛋白［(26.38±5.47)g/L比 (34.23±8.06)g/L，P=0.077］等方面差异无统计学意义。尿蛋白量＞3.5 g/d组患者的收缩压 ［(155.92±25.96)mmHg比(138.56±15.80)mmHg，P=0.047］、三酰甘油［(2.27±2.31)mmol/L比 (1.56±0.77)mmol/L，P=0.000］、低密度脂蛋白胆固醇 ［(5.08±1.90)mmol/L比 (3.64±1.00)mmol/L，P=0.017］、血肌酐 ［(136.31±56.72)μmol/L比 (115.81±32.67)μmol/L，P=0.028］和 24h尿 蛋白量［(9.18±5.02)g比 (2.21±0.89)g，P=0.000］均明显高于＜3.5 g/d组患者。

肾小球足细胞密度与蛋白尿的关系 采用足细胞核蛋白WT-1对足细胞数量进行标记 (图1)，IPP图像分析结果显示，尿蛋白量＞3.5 g/d组的足细胞密度为0.10个/μm2，明显低于尿蛋白量 ＜3.5 g/d组的0.15个/μm2(P=0.003)，且足细胞密度与蛋白尿量有明显相关性 (P=0.005)(图2)，其中尿蛋白量＞3.5 g/d组患者的足细胞密度减少程度比尿蛋白量＜3.5 g/d组的患者更明显。

DN患者synaptopodin和GRP78的表达和分布情况 随着蛋白尿量增加，synaptopodin和GRP78的表达逐渐下降，呈现分布不均、节段缺失，部分由线样变为颗粒状，免疫荧光强度降低 (图3)。IPP图像半定量分析显示，随着尿蛋白量增加肾小球内synaptopodin和GRP78表达逐渐降低。相关回归分析结果显示，DN患者的24 h尿蛋白量与synaptopodin和GRP78表达呈显著相关 (图4)，但尿蛋白量＞3.5 g/d组和 ＜3.5 g/d组患者的 synaptopodin(57.67 μm2比 65.86 μm2，P=0.575) 和 GRP78(52.92 μm2比 62.58 μm2，P=0.220)的阳性表达面积差异无统计学意义。

图1 足细胞威廉姆斯肿瘤蛋白-1免疫组织化学染色 (×200)Fig 1 Immunohistochemical staining of Wilms tumor 1(×200)

图2 糖尿病肾病患者随尿蛋白量增加足细胞密度下降Fig 2 Podocyte density decreases with the increase of urine protein in diabetic nephropathy patients

图3 肾组织synaptopodin和GRP78表达 (×1000)Fig 3 Expressions of synaptopodin and GRP78 in renal tissue(×1000)

图4 糖尿病肾病患者随尿蛋白量增加足细胞synaptopodin和GRP78表达下降Fig 4 The podocytes synaptopodin and the GRP78 expression decrease with the increase of urinary protein in diabetic nephropathy patients

讨 论

肾小球足细胞受到损伤时生物学特性会发生改变并发生脱落。synaptopodin是一种肌动蛋白结合蛋白，其表达沿足细胞基底膜排列，具有调节足突形状及运动和肾小球滤过的能力。WT-1是足细胞特异性核蛋白，其数量可以间接代表足细胞的数量。故本研究以synaptopodin作为足细胞骨架损伤的标记，WT-1作为足细胞数量标记，观察DN患者足细胞损伤与内质网应激的关系。

内质网是细胞内蛋白质组装、折叠、修饰和转运的场所，能对脂质及一些类固醇进行处理，同时也是细胞内钙离子的储存库［7］。当机体处于低氧、低糖或有害刺激作用下时，内质网应激被激活，内质网应激是由大量未折叠蛋白在内质网中堆积引发的。GRP78是一种内质网应激伴侣蛋白，其增高间接表明内质网应激和细胞适应性反应的出现。静息状态下，GRP78锚定在内质网膜上，当细胞处于应激状态时，GRP78与内质网膜上的下游蛋白发生解离，下游蛋白进一步作用于靶基因影响蛋白折叠和运输，使细胞内环境趋于稳定［8］。Cybulsky等［9］研究发现在海曼肾炎中内质网应激蛋白表达增高，此后进一步证明内质网应激参与了膜性肾病小鼠蛋白尿的产生，并证实对内质网应激进行诱导可以减轻肾损伤［10］。Inagi等［11-12］在微小病变肾病动物模型身上发现GRP78表达升高，并且伴大量蛋白尿，初步证实内质网应激与蛋白尿存在一定关系。此后研究都表明，在微小病变 (minimal change nephropathy，MCD)、膜性肾病 (membranous nephropathy，MN)、局灶节段性肾小球硬化 (focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)肾病患者的肾脏中存在内质网应激蛋白GRP78高表达，并且与蛋白尿量具有相关性，提示多种肾病患者都有内质网应激的产生［13］。Lindenmeyer等［14］采用葡萄糖刺激体外培养的肾小管上皮，6 d后发现细胞中GRP78基因表达上调，随着肾损伤，内质网应激蛋白GRP78表达初期升高，随着损伤加重GRP78表达下调，提示内质网应激在多种肾损伤中发挥作用。

本研究结果显示，随着尿蛋白量的增加，DN患者肾组织足细胞的损伤逐渐加重，表现为足细胞数量减少和密度降低，说明足细胞密度与蛋白尿量的多少具有相关性。此外，随着足细胞骨架蛋白synaptopodin的表达减少，内质网应激蛋白GRP78表达也减少，免疫荧光染色结果证实，两者随着尿蛋白量增加而逐渐减少，分布也由沿肾小球基底膜线样排列变成片状或颗粒状，提示内质网应激与足细胞损伤具有一定相关性。

［1］Dreyer G，Hull S，Arrken Z，et al.The effect of ethnicity on the prevalence of diabetes and associated chronic kidney disease［J］.Med，2009，102(4):261-269.

［2］Meyer TW，Bennett PH.Nelson RC.Podocyte number predict long-term urinary excretion in Pima indians with type［J］.Diabetologia，1999，42(11):1341-1344.

［3］Wang X，Eno CO，Altman BJ，et al.ER stress modulates cellular metabolism ［J］.Biochem J，2011，435(1):285-295.

［4］Inagi R，Nangaku M，Onogi H，et al.Involvement of endoplasmic reticulum(ER)stress in podocyte injury induced by excessive protein accumulation ［J］.Kidney Int，2005，68(6):2639-2650.

［5］刘志红，李世军，陈朝红，等.糖尿病肾病患者祖细胞病变临床病理特征 ［J］.肾脏病与透析移植杂志，2003，12(2):144-148.

［6］Pagtalunan ME，Miller PL，Jumping-Eagle S，et al.Podocyte loss and progressive glomerular injury in typeⅡdiabetes［J］.J Clin Invest，1997，99(2):342-348.

［7］Chevet E，Cameron PH，Pelletier MF，et al.The endoplasmic reticulum:integration of protein folding，quality control，signaling and degradation ［J］.Curr Opin Struct Biol，2001，11(1):120-124.

［8］Kimura K，Jin H，Ogawa M，et al.Dysfunction of the ER chaperone BiP accelerates the renal tubular injury［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，366(4):1048-1053.

［9］Cybulsky AV，Takano T，Papillon J，et al.Complement C5b-9 membrane attack complex increases expression of endoplasmic reticulum stress proteins in glomerular epithelial cells［J］.Biol Chem，2002，277(44):41342-41351.

［10］Cybulsky AV，Takano T，Papillon J，et al.Role of the endoplasmic reticulum unfolded protein response in glomerular epithelial cell injury［J］.Biol Chem，2005，280(26):24396-24403.

［11］Inagi R，Nangaku M，Usuda N，et al.Novel serpinopathy in rat kidney and pancreas induced by overexpression of megsin ［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16(5):1339-1349.

［12］Inagi R，Nangaku M，Onogi H，et al.Involvement of endoplasmic reticulum(ER)stress in podocyte injury induced by excessive protein accumulation ［J］.Kidney Int，2005，68(6):2639-2650.

［13］Markan S，Kohli HS，Joshi K，et al.Up regulation of the GRP-78 and GADD-153 and down regulation of Bcl-2 proteins in primary glomerular diseases:a possible involvement of the ER stress pathway in glomerulonephritis［J］.Mol Cell Biochem，2009，324(1-2):131-138.

［14］Lindenmeyer MT，Rastaldi MP，Ikehata M，et al.Proteinuria and hyperglycemia induce endoplasmic reticulum stress［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19(11):2225-2236.

Correlations of Podocyte Injury with Glucose Regulated Protein 78 Expression and Proteinuria in Patients with Diabetic Nephropathy

LIU Ying-jiu，WEN Yu-bing，TAO Jian-ling，LI Jin-hong，SU Ying，YE Wei，LI Hang，LI Xue-mei，LI Xue-wang

Department of Nephrology，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

TAO Jian-ling Tel:010-69155054，E-mail:tao_jianling@yahoo.com.cn

ObjectiveTo explore the podocyte injury in patients with diabetic nephropathy(DN)and analyze its relationship with glucose regulated protein 78(GRP78)and proteinuria.MethodsThe clinical data of 48 patients diagnosed as DN by renal biopsy were reviewed.All patients were divided into two groups according to proteinuria(＞3.5 g/d，n=31 and ＜3.5 g/d，n=17).The density of podocytes was illustrated by immunohistochemistry staining of Wilms tumor-1(WT-1)，and the immunmoflourescence doublestaining results of synaptopodin and GRP78 in podocytes were also detected.ResultsThe podocyte density of urine protein＞3.5 g/d group was significantly lower than that of urine protein＞3.5 g/d group urine protein＜3.5 g/d group(P=0.003)，and it was negatively correlated with proteinuria(P=0.005).The expressionsof synaptopodin and GRP78 in podocytes were also negatively correlated with proteinuria(P=0.004 andP=0.001).ConclusionThe podocyte injury is aggravated with increased proteinuria in DN patients，along with the decrease of the adaptive ability of endoplasmic reticulum to stress.

podocyte;diabetic nephropathy;synaptopodin;glucose regulated protein 78

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):359-363

陶建瓴 电话:010-69155054，电子邮件:tao_jianling@yahoo.com.cn

R587.2;R365

A

1000-503X(2012)04-0359-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.009

国家自然科学基金 (30700373、81170665)和2010年北京协和医院青年基金Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30700373，81170665)and the Youth Fund of Peking Union Medical College Hospital

2011-09-25)

·论 著·