过氧化物酶体增殖激活受体γ激动剂对高血压患者外周血单核来源巨噬细胞血管紧张素转化酶2 mRNA表达的影响

李永勤，王世捷，王聪霞，高登峰，丁抗宁，牛小麟

1西安交通大学医学院第二医院心内科，西安 710004 2西安交通大学医学院生理与病理生理学系，西安 710061

过氧化物酶体增殖激活受体γ激动剂对高血压患者外周血单核来源巨噬细胞血管紧张素转化酶2 mRNA表达的影响

李永勤1，王世捷2，王聪霞1，高登峰1，丁抗宁1，牛小麟1

1西安交通大学医学院第二医院心内科，西安 7100042西安交通大学医学院生理与病理生理学系，西安 710061

目的观察过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)激动剂对高血压患者外周血单核来源巨噬细胞血管紧张素转化酶2(ACE2)mRNA表达的影响。方法将57例高血压病患者随机分为常规治疗组 (n=18)、替米沙坦组 (n=19)和贝那普利组 (n=20)，并以20名正常血压者为对照。测定各组外周血单核来源巨噬细胞ACE2 mRNA表达及治疗4、12周后ACE2 mRNA表达的变化情况。结果治疗4、12周后，替米沙坦组和贝那普利组的收缩压和舒张压明显低于常规治疗组 (P均＜0.01)，替米沙坦组又明显低于贝那普利组 (P均＜0.01)。高血压各组外周血中单核来源巨噬细胞ACE2 mRNA的表达均明显低于对照组 (P均＜0.01);治疗4、12周后，替米沙坦组和贝那普利组的ACE2 mRNA表达均明显高于常规治疗组 (P均＜0.01)，替米沙坦组又明显高于贝那普利组 (P均＜0.01)。结论PPARγ激动剂可增加高血压患者外周血单核来源巨噬细胞ACE2 mRNA的表达。

过氧化物酶体增殖激活受体γ激动剂;血管紧张素转化酶2;原发性高血压

血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)-血管紧张素 (1～7)-Mas受体 ［ACE2-Ang(1～7)-Mas］轴的作用是肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)中重要的组成部分，其作用主要是对抗ACE-AngⅡ-AT1轴的作用，以维持机体内环境的平衡［1］，尤其在心血管病理生理改变中 (如高血压、心力衰竭及血管、心肌重塑等)发挥着重要的作用［2］，已成为近年研究热点。本研究以外周血单核来源巨噬细胞ACE2 mRNA的表达为研究指标，观察了高血压患者ACE2 mRNA的表达情况，评估了过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)激动剂对ACE2 mRNA表达的影响，以期进一步明确ACE2在高血压发生、发展中的作用。

对象和方法

对象及分组 2008年3月至2010年3月在西安交通大学医学院第二医院心内科门诊就诊的高血压患者57例，其中，男30例，女27例，年龄46～68岁，排除继发性高血压、严重肾功能损害、肝功能损害、肥厚型心肌病、冠心病、风湿性心脏病、糖尿病、心功能衰竭以及对替米沙坦、贝那普利过敏者。入选患者行常规血压测定、血生化检查 (包括肝肾功能、血糖、血脂测定)，行心电图、X线胸片及心脏B超检查。高血压诊断符合1999年世界卫生组织与国际高血压学会 (WHO/ISH)高血压治疗指南中的诊断标准［收缩压＞140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒张压＞90 mmHg］。患者按随机原则分为3组:(1)常规治疗组 (n=18):降压药物可在钙离子拮抗剂的基础上加用β受体阻滞剂和利尿剂;(2)替米沙坦组 (n=19):在常规治疗基础上加用替米沙坦80 mg/d;(3)贝那普利组 (n=20):在常规治疗基础上加用贝那普利10 mg/d。对照组为2008年3月至2010年3月在西安交通大学医学院第二医院门诊行体格检查血压正常的健康对照者20人，在性别、年龄方面与高血压组相比差异无统计学意义 (P＞0.05)。高血压各组在钙离子拮抗剂、β受体阻滞剂和利尿剂的用药剂量方面差异无统计学意义 (P＞0.05)。

给药时机 试验开始前已在服用降压药物者，至少停服原降压药物5个半衰期，若血压水平达到入选标准，则进入本研究;初诊高血压者，两次就诊血压符合入选标准直接进入。4周、12周后复诊。

血压检测 固定医生，采用水银柱血压计测定坐位血压，共测量3次，取其平均值作为观测血压值。

外周血中单核来源巨噬细胞的分离及鉴定 取10 ml EDTA抗凝血以等体积生理盐水稀释后，依密度梯度离心法用淋巴细胞分离液2000 r/min、4℃离心20 min，分离出外周血单个核细胞，加入含10%类标准胎牛血清RPMI1640培养液中，在37℃、5%CO2培养箱中培养4 h，弃去非贴壁细胞，予0.25%胰蛋白酶收集贴壁单核巨噬细胞。用生理盐水洗涤1次，分装在1.5 ml Eppdorf管中。纯化后的单核细胞经抗 CD14单抗的流式细胞技术 (flow cytometry，FCM)及瑞氏染色证实，纯度均在80%以上。

巨噬细胞ACE2 mRNA表达的检测 采用RTPCR方法，参照试剂盒要求提取细胞总RNA，取2 μl RNA样本加98 μl 1‰ DEPC水。在紫外分光光度仪上测总RNA浓度及纯度，D260 nm/D280 nm以1.8～2.0为佳。再取 2 μg总 RNA进行 RT-PCR。ACE2引物(赛百盛基因技术有限公司合成):上游5'-CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3'，下游 5'-GAGCTAATGCATGCCATTCTCA-3'，扩增 片 段 为 108 bp。GAPDH(赛百盛基因技术有限公司合成):上游5'-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游 5'-TCTCGCTCCTGGAAGATGG-3'，扩增片段为216 bp。按下列条件进行扩增:94℃预变性2 min，98℃变性10 s，53℃退火30 s，68℃延伸1 min，循环35次，4℃保存。琼脂糖凝胶电泳，重复6次，凝胶成像系统分析光密度值，并与内参照GAPDH的比值作为半定量指标。

统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，结果以均数±标准差来表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，多个样本均数的两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

各高血压组治疗前后血压的变化 治疗前，各高血压组的收缩压和舒张压差异无统计学意义 (P均＞0.05);治疗4和12周后，替米沙坦组和贝那普利组的收缩压和舒张压均明显低于常规用药组 (P均＜0.01)，替米沙坦组的收缩压和舒张压又明显低于贝那普利组 (P均＜0.01)(表1)。

各组外周血中单核来源巨噬细胞ACE2 mRNA的表达情况 治疗前，对照组、常规治疗组、贝那普利组和替米沙坦组外周血单核来源巨噬细胞ACE2/GAPDH的比值分别为0.83±0.06、0.43±0.05、0.45±0.08和0.40±0.07，其中，常规治疗组、贝那普利组和替米沙坦组均明显低于对照组 (P均＜0.01)。治疗4周后，常规治疗组、贝那普利组和替米沙坦组外周血单核来源巨噬细胞ACE2/GAPDH的比值分别为0.45±0.09、0.62±0.03和0.78±0.06，其中，贝那普利组和替米沙坦组均明显高于常规治疗组及治疗前 (P均＜0.01)，替米沙坦组又明显高于贝那普利组 (P＜0.01)。治疗12周后，常规治疗组、贝那普利组和替米沙坦组外周血单核来源巨噬细胞 ACE2/GAPDH的比值分别为0.51±0.04、0.64±0.05和0.80±0.06，其中，贝那普利组和替米沙坦组均明显高于常规治疗组及治疗前 (P均＜0.01)，替米沙坦组又明显高于贝那普利组 (P＜0.01)。

讨 论

近年来，ACE2的发现使人们对RAS有了新的认识。ACE2是在2000年从人心力衰竭cDNA文库和人淋巴瘤文库中克隆出来的一种含有805个氨基酸的ACE类似物，也是Ⅰ型结构的锌依赖性膜金属蛋白酶，在催化区域与ACE有42%的同源性。研究证实，ACE2的主要功能是水解AngⅡ，生成另一种血管活性肽Ang(1～7)［3］。Ang(1～7)的主要作用是对抗AngⅡ对机体的不利影响，如收缩血管升高血压、促进动脉粥样硬化、促进心肌肥厚及间质纤维化、损害血管内皮功能等［4-5］。以往研究提示，ACE2基因是高血压相关基因，自发性高血压大鼠 (spontaneous hypertension rat，SHR)和盐敏感sabra高血压大鼠(salt sensitive sabra hypertensive rat，SBH)在发生高血压后ACE2的mRNA和蛋白水平均明显降低［6］。Mercure等［7］研究亦显示，ACE2失活的 C57BL/6大鼠基础血压相比对照组有一定升高，提示ACE2的活性及其基因表达在高血压的发生、发展中发挥重要作用。

表1 各组治疗前后血压的变化 (± s，mmHg)Table 1 Changes of blood pressure in different groups(± s，mmHg)

表1 各组治疗前后血压的变化 (± s，mmHg)Table 1 Changes of blood pressure in different groups(± s，mmHg)

1 mmHg=0.133 kPa;与常规治疗组比较，aP＜0.01;与贝那普利组比较，bP＜0.011 mmHg=0.133 kPa;aP＜0.01 compared with regular treatment group;bP＜0.01 compared with benazepril group

收缩压Systolic blood pressure 舒张压Dystolic blood pressure分组Group n 治疗前Before treatment治疗4周4 weeks after treatment治疗12周12 weeks after治疗12周12 weeks after treatment治疗前Before treatment治疗4周4 weeks after treatment treatment常规治疗组Regular treatment group贝那普利组Benazepril group替米沙坦组Telmisartan group 18156.5±5.8140.2±6.7137.2±4.3 20157.1±6.2134.1±8.5a 95.5±6.290.6±5.487.9±7.3 131.4±6.8a 19157.9±4.3125.6±5.5ab 96.4±5.784.4±6.3a 83.5±4.9a 122.3±7.2ab 97.4±4.978.7±3.8ab 77.3±5.1ab

目前针对ACE2-Ang(1～7)-Mas这一新代谢轴与心血管疾病的研究大多局限于动物实验，这主要是因为人体心肌、血管组织需用创伤性手段方可采集，因而限制了该领域的临床研究。Keidar等［8］研究发现，人外周血单核来源巨噬细胞与心肌细胞、血管内皮细胞一样，能够表达ACE mRNA和ACE2 mRNA，参与炎症、氧化应激反应、血管活性因子的调控等病理生理过程，且具有易于采集的优点。Keidar等［9］研究显示，体外分离培养的单核来源巨噬细胞对醛固酮拮抗剂干预后表现为ACE mRNA下调及ACE2 mRNA显著上调，这与在体动物心肌、血管组织在醛固酮干预之下的变化相一致。因此认为患者外周血中单核来源巨噬细胞可作为对RAS新代谢轴作用研究的媒介，由此间接反映心肌、血管组织中ACE2的作用。

替米沙坦是一种AT1受体拮抗剂，理论上能够完全阻断AngⅡ对机体的不利作用，而且与ACEI相比，因为不影响缓激肽的代谢，所以没有干咳的不良反应，临床应用的耐受性更好。有研究发现，血管紧张素受体拮抗剂可使ACE2的活性以及基因表达增加，从而将AngⅡ转换为Ang(1～7)发挥拮抗AngⅡ的作用，这也是血管紧张素受体拮抗剂产生有利作用的一种重要机制［10-11］。本研究结果显示，替米沙坦组经治疗4、12周后，血压控制优于常规治疗组和贝那普利组，患者耐受性好，无1例发生不良反应而停用药物。经治疗后患者外周血单核来源巨噬细胞ACE2 mRNA的表达明显上调，提示替米沙坦可能是通过阻断AT1受体，拮抗AngⅡ经AT1受体介导的血管收缩、升高血压作用，并上调ACE2 mRNA，增强ACE2活性，使Ang(1～7)的生成增加，从而发挥扩张血管和舒张血压的作用。

有研究显示，替米沙坦是一种PPARγ激动剂［12］。PPARγ是核受体超家族成员之一，被其激动剂特异激活后能改善胰岛素抵抗，降低血管平滑肌细胞胞内Ca2+浓度和血管张力，多水平抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统的活性，改善血管内皮功能，降低交感神经活性从而达到降压的作用。本研究发现，高血压患者使用替米沙坦后，其外周血中单核来源巨噬细胞ACE2 mRNA的表达明显升高，且替米沙坦组ACE2 mRNA的表达明显高于贝那普利组，推测替米沙坦增强ACE2 mRNA表达与PPARγ激活，抑制AngⅡ、ACE活性以及AT1受体有关。另外Ang(1～7)主要通过ACE分解代谢，应用ACEI贝那普利后Ang(1～7)分解减少，可能对ACE2产生反馈抑制，从而抵消了部分ACEI增高ACE2的作用，但关于替米沙坦优于贝那普利增强ACE2表达的机制还有待进一步研究。

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Effect of Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ Agonist on Angiotensin Converting Enzyme 2 mRNA Expression in Monocyte-derived Macrophages of Essential Hypertensive Patients

LI Yong-qin1，WANG Shi-jie2，WANG Cong-xia1，GAO Deng-feng1，DING Kang-ning1，NIU Xiao-lin1

1Department of Cardiology，the Second Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China2Department of Physiology and Pathophysiology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China

WANG Shi-jie Tel:029-81906067，E-mail:wang.shi.jie@stu.xjtu.edu.cn

ObjectiveTo study the effect of peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ)agonist on the angiotensin converting enzyme 2(ACE2)mRNA expression in monocyte-derived macrophages of essential hypertensive patients.MethodsTotally 57 essential hypertensive patients were randomly divided into three groups:conventional treatment group(n=18)，telmisartan group(n=19)，and benazepril group(n=20);20 patients with normal blood pressure were also selected as the control group.Monocyte-derived macrophages were isolated from blood samples of patients in all four groups.The expression of ACE2 mRNA in monocyte-derived macrophages was detected by RT-PCR before treatment and 4 and 12 weeks after treatment.ResultsFour and 12 weeks after treatment，the systolic pressure and diastolic pressure of telmisartan group and benazepri group were significantly lower than that of the conventional treatment group(allP＜0.01)，and the systolic pressure and diastolic pressure of telmisartan group were significantly lower than that of the benazepri group(bothP＜0.01).The expression of ACE2 mRNA in monocyte-derived macrophages were significantly lower in essential hypertensive patients than that in control group(P＜0.01).After having been treated for 4 weeks and 12 weeks，the expression of ACE2 mRNA in monocyte-derived macrophages of hypertensive patients in telmisartan and benazepril groups were significantly higher than that in conventional treatment group(allP＜0.01)，and the expression of ACE2 mRNA in telmisartan group was significantly higher than that in benazepril group(bothP＜0.01).ConclusionPPARγ agonist could increase the ACE2 mRNA expression in monocyte-derived macrophages of essential hypertensive patients.

peroxisome proliferator activated receptor γ agonist;angiotensin converting enzyme 2 mRNA;essential hypertension

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):379-383

王世捷 电话:029-81906067，电子邮件:wang.shi.jie@stu.xjtu.edu.cn

R544.1

A

1000-503X(2012)04-0379-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.013

陕西省科技攻关项目［2007K13-03(13)］Supported by the Key Science and Technology Program of Shaanxi Province，China［2007K13-03(13)］

2011-11-13)