G蛋白激活的内向整流型钾通道4基因研究进展

康永安，胡燕荣，李南方

1石河子大学医学院，新疆石河子 832000 2新疆维吾尔自治区人民医院高血压中心 新疆高血压研究所，乌鲁木齐 830001

G蛋白激活的内向整流型钾通道4基因研究进展

康永安1，胡燕荣2，李南方2

1石河子大学医学院，新疆石河子 8320002新疆维吾尔自治区人民医院高血压中心 新疆高血压研究所，乌鲁木齐 830001

G蛋白激活的内向整流型钾通道4(GIRK4)是G蛋白偶联内向整流型钾通道家族成员之一，由KCNJ5编码，广泛分布于哺乳动物心、脑等组织器官。近年研究发现，GIRK4基因异常表达与心房纤颤相关，而且可能与肥胖、代谢综合征等众多其他临床疾病的发生、发展密切相关，阐明GIRK4基因在临床疾病中的病理生理机制对探讨一些临床疾病新的诊治思路具有重要的开拓性意义。

G蛋白激活的内向整流型钾通道4;基因;钾通道

根据通道的功能特点及氨基酸序列可将现有的内向整流性钾通道 (inward rectifying potassium ion channel，Kir)家族分为 Kir1～7 7种类型［1］。G 蛋白激活的内向整流型钾通道 (G protein-coupled inward rectifier K+channel，GIRK or Kir3)是 Kir超家族7个成员中有代表性的一个亚家族，在各种组织中广泛分布。近年研究表明，GIRK基因的异常表达与心血管、神经系统、肿瘤、代谢及内分泌、血液等多个系统性疾病的发生密切相关，而GIRK4作为GIRK家族中重要成员之一，在许多临床疾病的发生发展过程中起着不可或缺的作用。本文就近年来国内外对GIRK4基因的研究进展做一综述。

GIRK4基因及蛋白结构

目前已知GIRK家族有5个成员 (GIRK1～5)，其中GIRK1～4已在哺乳动物体内发现，并得到相应的克隆体，分别由KCNJ 3、6/7、9、5所编码，其中GIRK4基因位于人类染色体11q24。小鼠GIRK4基因和其他GIRK亚单位基因结构相似，均含有4～7个外显子，GIRK1和GIRK2基因长度不到20 kb，而GIRK3和GIRK4的基因长度超过100 kb，GIRK4基因mRNA的大小为1260 bp。

目前GIRK4亚基氨基酸的序列已经清楚，人类GIRK4亚基氨基酸数目是419，在各物种间GIRK4的同源性通常超过90%，GIRK4与GIRK其他亚基氨基酸序列的同源性在60%～80%间，氨基端前40个氨基酸和360位氨基酸以后的羧基端变化最大。机体内GIRK通道存在同源和异源四聚体，分别由4个相同和不同的亚基组成，GIRK4既能单独形成同源四聚体，也能和其他亚基共同形成异源四聚体，但同源四聚体的效率低于异源四聚体。在GIRK4和GIRK1组成的异源四聚体中，GIRK4是通道功能必须亚基［2］，而且GIRK4可能具有调节GIRK1表达的作用［3］，GIRK1也是功能性 GIRK通道的重要组成部分，能够增强通道功能［1，4］，但 GIRK1自身不能形成功能性的通道［5］。GIRK4在GIRK功能性异源或同源四聚体构成中的优势使GIRK4基因的异常表达在机体组织中具有重要的病理生理意义，在对GIRK家族的探索研究中，GIRK4基因成为了众多科研工作者的选择。含有GIRK4的功能性GIRK通道，每个亚基都具有相似的分子结构，具有两个α螺旋跨膜肽段 (M1和M2)，由通道孔区结构H5连接［5-6］，亚基疏水性的C末端和N末端位于质膜内，其与磷脂酰肌 醇-4，5-二 磷 酸 (phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2)结合可能与GIRK通道激活有关。

GIRK4在机体内的分布

GIRK4同GIRK家族其他成员一样广泛分布于机体内多个脏器组织。Schoots等［7］在1999年用Northern blot技术就已证实了GIRK4广泛分布于人体胰腺、胎盘、肺、心、脑、肾等脏器。近年研究表明，GIRK4基因在人体血小板、肾上腺、乳房肿瘤细胞［8-9］等组织脏器均有表达，但目前研究热点仍集中在心、脑等脏器。

GIRK4在心脏主要以乙酰胆碱敏感性钾通道(acetylcholine sensitive potassium channel，KAch)的形式存在，KAch由 GIRK1、GIRK4亚基组成［6］，是GIRK家族成员在心脏的主要存在形式，主要分布于心房肌、窦房结和房室结、蒲肯野纤维。在心房肌50%的KAch通道是GIRK4和GIRK1亚基组成的异源四聚体，其他50%则是完全由GIRK4亚基组成的同源四聚体，但目前研究认为GIRK1/GIRK4异源四聚体是心脏功能性KAch通道的表现型［10］。

GIRK家族成员在整个脑区均有分布，且GIRK1～3的分布情况相似，但相比之下，GIRK4在中枢神经系统的分布较为局限。动物研究发现，GIRK4在小鼠脑区的分布如下:皮层深部的椎体神经元、内侧梨状层的核团、脑岛皮层的屏状核、下丘脑腹内侧核、锥状束旁核、下丘脑室旁核和脑干的核团 (下橄榄核、前庭核)。而在大鼠，GIRK4则主要分布于小脑颗粒细胞层、臭球区颗粒细胞层和僧帽细胞层、中脑上丘、外侧隔核、海马齿状回颗粒和CA1～3椎体神经元［11］。此外GIRK4在哺乳动物脑干亦有较高表达，在舌下神经核、三叉神经核、动眼神经核、红核、侧脑室、第三和第四脑室脉络丛及基底神经节均有低水平表达。总之，随着人们对GIRK4基因研究的深入，其在机体内的表达谱将逐步得到完善。

GIRK4的功能调控

由GIRK4亚基组成的同源或异源性GIRK通道，能够被G蛋白 (由α、β、γ 3个亚基组成的三聚体，位于细胞膜的胞液侧)、PIP2、细胞内钠离子、乙醇、机械牵拉等因素调节激活［12］，但在机体组织中仍以经典的G蛋白偶联信号传导为主，即受体与配体结合导致受体构象改变，从而使结合在Gαβγ三聚体的 GDP 在 Gα上交换为 GTP，Gαβγ解离成 Gα、Gβγ，Gβγ直接作用于通道蛋白激活GIRK通道［13］，随后具有 GTP酶活性的Gα水解GTP，Gβγ再与Gα-GDP结合导致GIRK失活。G蛋白信号调控因子 (regulator of G-protein signalling，RGS)因能加速Gi/Go的GTP酶水解速度，从而能提高GIRK的失活。Gβγ与GIRK4亚基结合在KAch通道激活过程中具有着重要作用，Krapivinsky等［14］用模拟肽竞争实验研究显示，源于GIRK4(209～225)、GIRK4(226～245)、GIRK1(364～383)的衍生肽能够竞争抑制G蛋白βγ亚基与GIRK4/GIRK1异聚体的结合，提示上述区域可能存在G蛋白βγ亚基调节位点。郑兴东等［15］在此基础上进一步研究发现，GIRK4 N端膜内域中的41～92区和C端膜内域中的253～348区分别是G蛋白βγ亚基的最小结合区域，该研究为进一步确定Gβγ激活GIRK通道的调节位点、明确其中关键氨基酸残基的组成奠定了基础，有助于阐明GIRK4通道具体的调控机制，为实现基因后水平干预GIRK4基因异常表达对机体造成的危害带来新的途径。

GIRK4的病理生理意义

GIRK4与心血管系统的关系 心脏K+通道决定静息膜电位、心率、动作电位的形状和持续时间，是神经递质、激素、药物作用的靶点。KAch是GIRK4在心脏的主要存在形式，具有调节心律、维持静息膜电位的作用，参与迷走神经对心脏功能的调节，激活心房肌KAch通道能使动作电位时程缩短、膜电位超极化，激活窦房结和房室结KAch通道使心率和窦房传导减慢。G蛋白信号调控因子 (RGS4、RGS6)因参与迷走神经和KAch通道的调节，而对窦性心率的调节具有重要作用。

心房纤颤 (简称房颤)是临床上最常见的心律失常之一，其与GIRK4基因的关系是目前研究热点。Dobrev等［16］研究表明，房颤患者的心肌组织中乙酰胆碱敏感性钾电流 (acetylcholine sensitive potassium current，IKAch)的密度较窦性心律者减少约50%。高翔等［17］研究表明，慢性房颤患者KAch通道蛋白 mRNA及蛋白含量均较对照组患者减少。在慢性房颤患者的心房组织中，GIRK1和GIRK4 mRNA水平降低，KAch通道功能下降，其中GIRK1 mRNA水平降低，有利于GIRK4亚型纯合体的形成，而GIRK4亚型纯合体的基础开放概率较高，且对细胞内Na+非常敏感，因此在心力衰竭等疾病状态存在水钠储留、电解质紊乱的病理条件下，GIRK4通道纯合体活性加强，有效不应期缩短，易于产生房颤。Brundel等［18］研究阵发性房颤患者发现，KAch通道蛋白表达虽下降，但其mRNA表达水平却无明显变化，认为阵发性房颤患者KAch通道蛋白表达调控可能发生于转录后水平。

目前认为GIRK通道基因重组是GIRK功能低下和产生房颤的重要原因［10］，如 GIRK4基因多个SNPs位点中，C171T、G810T位点可能是房颤的危险因素［19］。Calloe等［20］研究发现，房颤患者 GIRK4基因突变，导致GIRK4通道亚单位中精氨酸被甘氨酸替代，能够影响Gβγ对KAch通道的激活，但其与房颤的关系有待进一步研究证实。

随着GIRK4基因异常表达在房颤中的作用地位初步得到确认，从基因水平探索房颤等心律失常的治疗方案是目前研究热点。Liu等［21］将携带人GIRK4 shRNA片段的重组腺病毒载体 (Ad-GIRK4-shRNA)转染人心房肌细胞，沉默心房肌GIRK4基因表达，并用RT-PCR和Western blot技术检测，发现GIRK4基因mRNA和蛋白的表达水平分别较对照组减少了86.3%和51.1%，同时IKAch减少了53%。这一研究结果提示Ad-GIRK4-shRNA干涉GIRK4基因在心脏的表达对房颤等心律失常可能具有潜在的治疗效应［22］。Walsh［23］研究表明，采用分子水平的实时筛选测定法有望为房颤治疗筛选出新的且具有选择性的因子，以研制GIRK1/4通道抑制剂用于房颤的治疗。

GIRK4与神经系统的关系 GIRK各亚基在中枢神经系统的分布比较广泛，与脑功能关系较为密切，GIRK通过与许多受体偶联 (如GABAB受体、阿片受体、D2多巴胺受体、M2毒蕈碱受体、α2肾上腺素受体)，在维持膜静息电位及调节神经细胞兴奋性方面发挥重要作用。Ehrengruber等［24］研究表明，将GIRK4、GIRK2、GIRK1和5-HT1A受体共转染培养的海马神经元，在给予5-HT后发现，由于GIRK的激活而使神经元兴奋性的阈值增加了2～3倍，最终抑制神经元的放电频率，可见GIRK4在中枢神经系统调节神经元的兴奋性中具有一定作用。Wickman等［25］用GIRK4基因敲除小鼠研究动物行为学发现，GIRK4基因敲除小鼠表现为与水迷宫功能相关的空间识别和记忆能力下降，而未发现明显视觉、痛觉及运动器官功能障碍。

Perry等［26］研究表明，GIRK4基因在下丘脑调节摄食和能量平衡中枢有较高的表达水平，GIRK4基因敲除小鼠可导致小鼠体重增加25%以上，并导致小鼠的食物摄取量增多而能量消耗减少，提示GIRK4基因在下丘脑的表达可能与肥胖、代谢综合征等疾病发生密切相关。以上研究结果表明，中枢神经系统不同区域GIRK4基因表达具有不同的病理生理意义，最终在复杂的中枢神经系统中分别扮演一定角色，然而中枢神经系统的复杂性和GIRK4在神经系统表达的局限性，给人们认识GIRK4与中枢神经系统的关系带来了一定困难，需要进一步深入研究。Williams等［27］研究表明，使用阳离子脂质体为基础的基因转染是一种在神经元中直接、有效的异源表达方法，这一研究成果将促进神经科学的长足发展。

GIRK4除了在心、脑等重要脏器中具有重要的病理生理意义外，目前研究发现其与血液系统、消化系统、肾上腺等组织系统性疾病的发生发展也具有密 切 关 系。Shankar等［28］研 究 表 明，GIRK4、GIRK1、GIRK2基因在人类血小板的功能性表达对P2Y12受体介导的血小板聚集、致密颗粒的释放等生理功能具有重要作用，这些基因异常表达可能影响血液的凝集状态，进而可能对脑卒中、凝血功能障碍性疾病的发生产生影响。卢强等［29］利用RT-PCR、Western blot方法初步检测到人食管平滑肌细胞中存在GIRK2、GIRK3、GIRK4表达，且以 GIRK4表达最丰富;进一步研究表明Ad-GIRK4-shRNA可高效、成功转染人食管平滑肌细胞，其能在mRNA和蛋白水平降低GIRK4的表达，GIRK4表达下降能导致M2AChR表达的增高，IKAch的电流密度下降，提示GIRK4可能在食管M2受体-G蛋白-IKAch通路和IKAch通道中起重要作用。这一探索性研究有望为将RNA干扰技术引入食管运动功能障碍机制的研究、基因治疗提供新思路。最近Choi等［30］研究发现，GIRK4基因的遗传变异可能与肾上腺腺瘤异常增生分泌过多醛固酮引起继发性高血压相关。GIRK4相关活性通道作为钾离子通道的一种特殊形式，其在机体的生命活动中具有着意义。GIRK4基因和其他基因一样，由于遗传变异或环境等因素影响了其正常表达状态，势必造成机体出现相应的脏器功能变化，从基因水平干预这一异常变化是目前广大科研工作者研究基因的意义所在，也是临床工作者治疗疾病最理想的利器。

总之，随着分子生物学技术的改进，近年人们对GIRK家族中较为活跃的GIRK4的分子生物学基础及其生理功能的研究得到了前所未有的进展，并且发现GIRK4基因异常表达可能和许多临床疾病的发生发展密切相关，但目前无论对GIRK4或GIRK家族其他成员在许多临床相关疾病中的发病机制仍不十分清楚，许多研究尚处于动物实验阶段，把这些理论进行成果转化用于临床，最终实现从基因和蛋白水平干预GIRK4基因异常表达来治疗临床相关疾病，还需要科研工作者做出进一步的努力。

［1］Abraham MR，JahangirA，Alekseev AE，et al.Channelopathies of inwardly rectifying potassium channels［J］.Faseb J，1999，13(14):1901-1910.

［2］Krapivinsky G，Gordon E，Wickman K，et al.The G-protein gated atrial K+channel IK，ACh is a heteromultimer of two inwardly rectifying K+channel proteins［J］.Nature，1995，374(6518):135-141.

［3］Wickman K，Nemec J，Gendler SJ，et al.Abnormal heart rate regulation in GIRK4 knockout mice ［J］.Neuron，1998，20(1):103-114.

［4］Isomoto S，Kondo C，Kurachi Y.Inwardly rectifying potassium channels;their molecular heterogeneity and function［J］.Jpn J Physiol，1997，47(1):11-39.

［5］Mark MD，Herlitze S.G-protein mediated gating of inward rectifier K+channels［J］.Eur J Biochem，2000，267(19):5830-5836.

［6］Dascal N.Signalling via the G protein-activated K+channels［J］.Cell Signal，1997，9(8):551-573.

［7］Schoots O，Wilson JM，Ethier N，et al.Co-expression of human Kir3 subunits can yield channels with different functional properties ［J］.Cell Signal，1999，11(12):871-883.

［8］Dhar MS，Plummer HK 3rd.Protein expression of G-protein inwardly rectifying potassium channels(GIRK)in breast cancer cells［J］.BMC Physiol，2006，8(31):6-8.

［9］Wagner V，Stadelmeyer E，Riederer M，et al.Cloning and characterisation of GIRK1 variants resulting from alternative RNA editing of the KCNJ3 gene transcript in a human breast cancer cell line［J］.J Cell Biochem，2010，110(3):598-608.

［10］陆彤，蒋彬.内向整流性钾离子通道家族［J］.中国心脏起搏与心电生理杂志，2009，23(3):189-195.

［11］Wickman K，Karschin C，Karschin A，et al.Brain localization and behavioral impact of the G-protein-gated K+channel subunit GIRK4 ［J］.J Neurosci，2000，20(15):5608-5615.

［12］Hedin KE，Lim NF，Clapham DE.Cloning of a Xenopus laevis inwardly rectifying K+channel subunit that permits GIRK1 expression of IKACh currents in oocytes［J］.Neu-ron，1996，16(2):423-429.

［13］Chan KW，Sui JL，Vivaudou M，et al.Control of channel activity through a unique amino acid residue of a G proteingated inwardly rectifying K+channel subunit［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(24):14193-14198.

［14］Krapivinsky G，Kennedy ME，Nemec J，et al.Gβγbinding to GIRK4 subunit is critical for G protein-gated K+channel activation［J］.J Biol Chem，1998，273(27):16946-16952.

［15］郑兴东，陈哲宇，由振东，等.钾通道GIRK4中G蛋白βγ亚基结合区的研究［J］.中国神经科学杂志，2001，17(3):205-208.

［16］Dobrev D，Graf E，Wettwer E，et al.Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K(+)current I(K，ACh)in chronic human atrial fibrillation:decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced I(K，ACh)and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials［J］.Circulation，2001，104(21):2551-2557.

［17］高翔，刘金平，王玉，等.心房颤动患者心房肌乙酰胆碱兴奋钾电流通道基因和蛋白的表达［J］.临床心血管病杂志，2009，25(8):569-572.

［18］Brundel BJ，Van Gelder IC，Henning RH，et al.Ion channel remodeling is related to intraoperative atrial effective refractory periods in patients with paroxysmal and persistent atrial fibrillation［J］.Circulation，2001，103(5):684-690.

［19］Zhang C，Yuan GH，Cheng ZF，et al.The single nucleotide polymorphisms of Kir3.4 gene and their correlation with lone paroxysmal atrial fibrillation in Chinese Han population［J］.Heart Lung Circ，2009，18(4):257-261.

［20］Calloe K，Ravn LS，Schmitt N，et al.Characterizations of a loss-of-function mutation in the Kir3.4 channel subunit［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，364(4):889-895.

［21］Liu X，Yang J，Shang F，et al.Silencing GIRK4 expression in human atrial myocytes by adenovirus-delivered small hairpin RNA［J］.Mol Biol Rep，2009，36(6):1345-1352.

［22］Luscher C，Slesinger PA.Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium(GIRK)channels in health and disease ［J］.Nat Rev Neurosci，2010，11(5):301-315.

［23］Walsh KB.A real-time screening assay for GIRK1/4 channel blockers［J］.J Biomol Screen，2010，15(10):1229-1237.

［24］Ehrengruber MU，Doupnik CA，Xu F，et al.Activation of heteromeric G protein-gated inward rectifier K+channels overexpressed by adenovirus gene transfer inhibits the excitability of hippocampal neurons ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(7):7070-7075.

［25］Wickman K，Karschin C，Karschin A，et al.Brain localization and behavioral impact of the G-protein-gated K+channel subunit GIRK4 ［J］.J Neurosci，2000，20(15):5608-5615.

［26］Perry CA，Pravetoni M，Teske JA，et al.Predisposition to late-onset obesity in GIRK4 knockout mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(23):8148-8153.

［27］Williams DJ，Puhl HL，Ikeda SR.A simple，highly efficient method for heterologous expression in mammalian primary neurons using cationic lipid-mediated mRNA transfection［J］.Front Neurosci，2010，4:181.

［28］Shankar H，Kahner BN，Prabhakar J，et al.G-protein-gated inwardly rectifying potassium channels regulate ADP-induced cPLA2 activity in platelets through Src family kinases［J］.Blood，2006，108(9):3027-3034.

［29］卢强.RNA干扰人食管平滑肌细胞GIRK4基因表达的实验研究［D］.西安:第四军医大学，2009.

［30］Choi M，Scholl UI，Yue P，et al.K+channel mutations in adrenal aldosterone-producing adenomas and hereditary hypertension［J］.Science，2011，331(6018):768-772.

Advances in Research on G Protein-coupled Inward Rectifier K+Channel Gene

KANG Yong-an1，HU Yan-rong2，LI Nan-fang2

1Medical College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China2Hypertension Institute of Xinjiang，Hypertension Center of the People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China

LI Nan-fang Tel:0991-8564816，E-mail:Lnanfang@yahoo.com.cn

G protein-coupled inward rectifier K+channel 4(GIRK4)is a G protein-coupled inward rectifier potassium channel family member.Encoded by the KCNJ5，it is widely distributed in the mammalian heart，brain，and other tissues and organs.Recent studies have demonstrated that the abnormal expression of GIRK4 gene is associated with atrial fibrillation，and meanwhile may be closely related to obesity，metabolic syndrome，and many other clinical conditions.Further research on the role the GIRK4 gene in the pathophysiology of these clinical conditions will definitely facilitate their clinical diagnosis and treatment.

G protein-coupled inward rectifier K+channel 4;gene;potassium channel

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):426-430

李南方 电话:0991-8564816，电子邮件:Lnanfang@yahoo.com.cn

R394.3

A

1000-503X(2012)04-0426-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.023

新疆维吾尔自治区重点实验室“新疆高血压病研究室”开放课题 (XJYS0906-2011-05)Supported by the Open Project of Xinjiang Key Laboratory of Hypertension，Xinjiang Uygur Autonomous Region(XJYS0906-2011-05)

2011-11-17)

·论 著·