利用黑曲霉和酵母共发酵秸秆产乙醇的研究

杜苏萌 赵金安

（太原工业学院 环境与安全工程系，山西 太原 030008）

利用黑曲霉和酵母共发酵秸秆产乙醇的研究

杜苏萌 赵金安

（太原工业学院 环境与安全工程系，山西 太原 030008）

利用黑曲霉降解秸秆的效果，黑曲霉和酵母共发酵条件的优化以及在最优条件下产乙醇的效果.从秸秆腐殖质土中筛选出9株黑曲霉，并用刚果红鉴别培养基筛选出水解圈比较大的两株菌，从p H、温度、发酵时间对两株菌进行产纤维素酶的优化，并将黑曲霉和酵母在最适条件下共发酵生产乙醇.最后得出p H＝5，温度为32℃，发酵时间为72 h时酶活最高，液体发酵在上述适宜条件下降解秸秆72 h后接种酵母进行共发酵24 h，生产出乙醇，质量比是3%.

纤维素降解菌；筛选；酶活；共发酵；秸秆

石油的大量消耗给人们带来了各种问题，主要有能源危机和环境问题，试图开发一种可替代性燃料缓解能源和环境问题已经是各国广泛关注的焦点［1］.乙醇燃烧后变成水和二氧化碳对环境污染小，而且释放能量多，因此开发乙醇燃料已成为研究的热点［2M3］.我国是农业种植大国，每年产生很多玉米农作物秸秆，这些秸秆植物质经过微生物发酵可以转化成乙醇［4，5］.目前发现可以代谢秸秆的微生物有很多种，其中主要的一种菌包括黑曲霉［6］.本研究就是从腐烂的秸秆及秸秆下的腐殖土样品中共筛选出9株黑曲霉，并对这9株黑曲霉进行酶活测定，最后选出2株产酶高的菌株进行不同p H、不同发酵时间、不同温度三个条件对产纤维素酶能力的影响，并研究了黑曲霉与酵母共发酵生产乙醇的效果［7］.

1 材料

1.1 试剂

葡萄糖标准溶液（2 mg／ml）

柠檬酸缓冲液（0.05 mol／L，p H 为5.0）

羧甲基纤维素钠溶液（0.51%，CMC）

3，5－二硝基水杨酸试剂（DNS）

1.2 菌株

在太原市北固碾村玉米地土样品中筛选得到9株黑曲霉，酵母为学校实验室保存

1.3 培养基

琼脂纤维素培养基（MgSO4·7 H2O 1.0 g，CaCO32.0 g，（NH4）2SO42.0 g，NaCl 1.0 g，琼脂20.0 g，加H2O定容到500 m L，自然p H，滤纸和培养皿大小一样）

刚果红培养基（微晶纤维素1.88 g，（NH4）2SO42.0 g，琼脂14.0 g，MgSO40.25 g，K2HPO40.5 g，刚果红0.2 g，加 H2O定容到1 000 m L，p H为6～7）

羧甲基纤维素钠培养基（保藏用）

（羧甲基纤维素钠15.0 g，KH2PO40.5 g，NaCl 6.0 g，（NH4）2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，CaCl20.1 g，K2HPO42.0 g，酵母粉1.0 g，加 H2O至1 000 m L，p H 为5.0），

发酵培养基（液体）

（秸秆粉40.0 g，（NH4）2SO42.0 g，NaCl 6.0 g，MgSO4·7 H2O 0.1 g，K2HPO42.0 g，CaCl20.1 g，酵母粉1.0 g，KH2PO40.5 g，加 H2O定容到1 000 m L，p H 为5.0）

2 方法

2.1 纤维素降解菌的初筛实验

将采集的秸秆土质样品用无菌水溶解，配制几个稀释度，取10－3，10－4，10－5三个稀释度样品均匀涂布于琼脂纤维素培养基，三个稀释度各涂布三个培养皿，置于恒温培养箱28℃培养，定时观察并记录滤纸条的降解情况，从滤纸上的溃烂斑处挑取菌落于CMC培养基上进行纯化最后得到单菌落.

将分离后得到的单菌落接种在刚果红培养基平板上，置于恒温箱中28℃培养，挑选在培养皿上长得快、透明水解圈比较大的单菌落，保存在CMC培养基上备用.

2.2 纤维素降解菌的复筛实验

用液体发酵培养基培养初筛得到的单菌落中，定时取样（本实验为24 h）测定羧甲基纤维素酶活（CMC）和还原糖的变化情况，将CMC酶活高及还原糖累积浓度高的菌种，保存在保藏培养基上作为备用菌种.

绘制葡萄糖标准曲线：取6支比色管（体积为25 m L），配置成6个不同浓度的葡萄糖溶液，然后绘制葡萄糖标准曲线如图1：

测定羧甲基纤维素酶活（CMC）：将6个比色皿分别编号后各加入3，5-二硝基水杨酸试剂1.5 ml以钝化酶活性.同时将比色皿置于45℃水浴锅中预热5～10 min，然后向各管中加入粗酶液0.1 m L，45℃继续保温0.5 h.保温结束后立即向每个比色皿中各加入3，5二硝基水杨酸1.5 m L终止酶反应.摇匀后沸水浴5 min，取出冷却后蒸馏水定容.设空白对照溶液，在波长540 nm处测定吸光度值并将结果记录.最后在上述绘制出的标准曲线上查出相应的葡萄糖含量.按以下公式计算CMC酶活力：

图1 葡萄糖标准曲线

式中：G—在标准曲线上查得还原糖的量；n—酶液的稀释倍数；V—酶液体积，t—时间，1 000—由mg换算成ug的换算因子.

分别测定p H＝3，4，5，6，7，8几个p H条件下对液体培养基发酵产酶的影响，不同发酵时间0 h，24 h，48 h，72 h，96 h，120 h几个时间段还原糖含量和酶活测定.

乙醇发酵实验在500 mL三角瓶中进行，内含200 m L液体培养基，接种A-2菌种10%，置于恒温振荡培养箱28℃，150 r／min条件下培养72 h，再加入酵母接种量也为10%，放于恒温培养箱28℃，下静置培养24 h.

乙醇蒸馏在500 m L蒸馏瓶中进行，内含150 m L发酵液，内加玻璃珠以控制沸腾速度.在100 m L容量瓶中加入10 m L蒸馏水并插入冷凝管，冷凝管延伸部分的末端浸入水中.收集馏出液，延伸部分用水冲洗后停止蒸馏.乙醇的鉴定 在硫酸介质中，向馏出液中加入2ml的质量比为5%重铬酸钾，观察颜色是否由橙红色变为绿色.

3 结果与讨论

3.1 结果

从表1中可以看出A-3，B-1两个菌株的水解圈直径比较大，产酶能力最强，选这两株菌进行不同发酵时间葡萄糖含量和酶活测定，如图2，图3.

表1 初筛9个菌株的刚果红培养基水解圈直径大小

图2 两株菌不同发酵时间的酶活测定

图3 不同p H值下测得的CMC酶活曲线

从图2上可以看出大约在72 h时两株菌酶活最高，低于或高于72 h酶活都有所降低.

从图3上可以看出在p H为5时两株菌的酶活最高，低于或高于p H＝5时两株菌酶活都有所降低.

对上述两株菌在p H＝5，温度为32℃下发酵72 h后接种10%的酵母，置于28℃恒温培养箱静置培养24 h，用质量比为5%重铬酸钾溶液进行乙醇鉴定，颜色由橙红色变为绿色，说明乙醇产生，经测定乙醇质量比为3%.

3.2 讨论

本研究从秸秆腐质土中共筛选出9株黑曲霉菌，其中通过刚果红培养基鉴定水解圈大小和酶活测定有2株黑曲霉菌（编号为A-3、B-1）属于高产酶菌株，将这两株菌用于后面的产酶因素影响和发酵条件优化研究，最后得出p H＝5，温度32℃，降解秸秆粉72 h时酶活最高，应该在此条件下降解秸秆粉，达到适宜条件后接种10%的酵母，将黑曲霉和酵母进行发酵24 h，颜色变绿可以得知生产出乙醇，经测定质量比为3%.如何提高乙醇得率有待进一步研究.

［1］ 郭夏丽，杨小丽，李顺义，王 岩.秸秆降解菌的筛选及菌种组合［J］.郑州大学学报（工学版），2010，31（1）：74-77

［2］ 胡立明，谢 宇，李 洁.黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件的研究［J］.河南工业大学学报（自然科学版），2007，28（1）：70-74

［3］ 马旭光，蔺海明，刘星斌.黑曲霉高产纤维素酶活突变株ZM-8的筛选［J］.中国饲料，2007（5）：30-32

［4］ 谢小保，谭 宏，黄小茉.黑曲霉 GD6纤维素酶液体发酵条件的研究［J］.微生物学杂志，2004，24（2）：21-23

［5］ 张素平，颜涌捷，任铮伟，等.纤维素制曲乙醇技术［J］.化学进展，2007，19（7）：1 129-1 133

［6］ 王站勇，苏婷婷.产纤维素酶黑曲霉 LN0401液体发酵条件分析［J］.辽宁石油化工大学学报，2006，26（2）：28-29

［7］ 潘俊波，李 金，徐凤华.高效纤维素降解菌的筛选［J］.东北农业大学学报，2006，37（2）：175-179

The Study of Fermentation Production for Fuel-Ethanol by Aspergillus.niger And Yeast

Du Sumeng Zhao Jinan
（Taiyuan institute of technology，environment and safety engineering department，Taiyuan 030008，China）

To study the effect of degrading straw using Aspergillus.niger，and to look for the best condition under which to research the effect of producing Ethanol.screen nine Aspergillus.niger from straw humus soil，and select two strains whose hydrolysis ring are larger on congo red culture medium，and study the affect of p H、temperature，fermentation time to production for enzyme，and study the fermentation production for Ethanol by Aspergillus.niger and Yeast under the most suitable condition.When the p H is 5，the temperature is 32℃the fermentation time is 72 hours，enzyme activity lies the highest.Liquid fermentation for ethanol succeed by Aspergillus.niger And Yeast after 24 hours of adding the Aspergillus.niger And Yeast.The production rate of ethanol is 3%.

Cellulose-deposing microbes；screen；enzyme activity；fermentation by Aspergillus.niger And Yeast；straw

张丽萍】

1672-2027（2012）03-0132-03

Q815

A

2012-06-22

杜苏萌（1982-），女，山西运城人，硕士，太原工业学院助教，主要从事微生物学研究.