UPLC-MS-MS法快速测定玉米中的黄曲霉毒素B1

于成广

（济南市农业质量检测中心，济南 250002）

黄辉

（中国兵器工业集团第五三研究所，济南 250031）

UPLC-MS-MS法快速测定玉米中的黄曲霉毒素B1

于成广

（济南市农业质量检测中心，济南 250002）

黄辉

（中国兵器工业集团第五三研究所，济南 250031）

采用高效液相色谱–串联质谱法检测玉米中的黄曲霉毒素B1。对样品前处理条件、净化和分离条件进行了优化，黄曲霉毒素B1检出限为0.02 μg／kg，回收率为83.8%～95.7%。建立的方法简便、快速、灵敏度高，能够满足玉米中痕量黄曲霉毒素B1农残的高灵敏测定要求。

黄曲霉毒素B1；高效液相色谱串联质谱；玉米

黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种高毒性与高致癌性的物质，毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药，在所有的已知真菌毒素中， 黄曲霉毒素B1的毒性、致癌性是最强的， 也是所有真菌毒素中最稳定的一种［1］。研究一种具有高灵敏度、高选择性的测定黄曲霉毒素的方法，对于食品的安全性检测和食品的质量控制具有重要的意义。

目前应用比较广泛的黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)［2］、高效液相色谱法(HPLC)［3，4］、酶联免疫吸附测定法 ( ELISA)［5,6］等。薄层色谱法操作繁琐、污染大、定量差、耗时长；而酶联免疫法虽然操作简单、灵敏度高，但特异性差；普通的HPLC结合荧光检测的方法，黄曲霉毒素需要经过衍生化以后才能进行测定，操作繁琐，分析时间长，消耗的溶剂量比较大［7,8］。笔者选用高效液相色谱串联质谱法，在选择反应监测(MRM)模式下对黄曲霉毒素B1进行定性、定量分析，方法简便、快速，具有较高的灵敏度和选择性［9］，能够对大批量样品进行快速分析。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱–三重四极杆质谱仪：UPLC／Quattro premier型，美国Waters公司；

电子天平：BSA623S型，北京赛多利斯公司；

氮吹仪：N-EVAP型，美国 Organomation公司；

漩涡振荡器：QL-866型，海门麒麟医用仪器厂；

超声波仪：SK5200LHC型，上海科导超声仪器有限公司；

固相萃取柱：HLB型，容量为3 mL／60 mg，美国Waters公司；

乙腈、甲酸：色谱纯，美国TEDIA 公司；

正己烷、氯化钠：分析纯，上海国药试剂有限公司；

黄曲霉毒素B1标准品：美国Sigma公司；

实验用水：取自Millipore纯水系统，电阻率不小于18.2 MΩ·cm。

1.2 色谱条件

色谱柱： C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流动相：乙腈–0.1%（体积分数）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.2 mL／min ；进样体积：5 μL ；柱温：35℃。

1.3 质谱条件

三重四极杆质谱系统；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子源：正离子分析模式；毛细管电压：3.2 kV；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：450 L／h；碰撞池压力：0.32 Pa；锥孔反吹气流量：50 L／h。

1.4 实验方法

（1）黄曲霉毒素B1标准溶液的配制

用乙腈将黄曲霉毒素B1配制成100 mg／mL标准储备液， 4℃避光保存。用乙腈–水溶液（体积比50∶50）稀释标准储备液，分别配制成0.2，0.5，2，5，10，20，50，60 μg／mL 黄曲霉毒素 B1 标准工作溶液。

（2）样品的提取

将玉米样品粉碎后过830 μm（20目）筛，称取5 g置于100 mL离心管中，加入50 mL乙腈–水溶液（体积比75∶25）、5 g氯化钠及20 mL正己烷，摇匀，放入离心机中离心提取30 min。固相萃取柱预先用4 mL甲醇活化，准确吸取上层清液10 mL过固相萃取柱，然后用4 mL甲醇分两次洗脱混合柱,合并洗脱液于10 mL离心管中，然后用氮气于40℃下吹干。用2 mL流动相溶解，涡旋30 s， 用0.22 μm微孔滤膜过滤于进样瓶中，进样5 μL。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的选择

分别使用丙酮、正己烷、乙腈萃取溶剂提取样品，发现乙腈的回收率较高。为了获得尽可能高的回收率，使用乙腈和水混合溶剂。当溶剂中乙腈与水的体积比在70∶30～90∶10之间时，溶剂萃取效率最高，黄曲霉毒素的回收率也均达到较高水平，所以最终选取75∶25乙腈–水作为实验预处理的萃取溶剂。另外，样品在乙腈水溶液中极易出现乳化现象，影响提取效率，在提取液中加入氯化钠能起到明显的破乳作用，同时可以增强离子化效应，使乙腈与水分层，同时也使目标物更完全地溶于乙腈中，起到较好的分离效果。此外，玉米成分复杂，含有色素和淀粉等基质，如果净化结果不理想，易产生干扰，污染色谱柱，将严重影响分离效果及检测灵敏度，使回收率降低。为了解决这个问题，必须得到更好的净化效果。经过反复实验，发现HLB固相萃取柱去除杂质和色素的能力较好，有较高的回收率。

2.2 流动相的选择

黄曲霉毒素B1易溶于甲醇和乙腈， 选择乙腈–水作流动相时， 色谱系统分离效果比甲醇–水好，可以获得较高的分辨率和灵敏度。将流动相中的水用0.1%的甲酸水溶液替代后得到的峰形更尖锐，灵敏度更高。实验表明，当乙腈和0.1%的甲酸水溶液的配比在70∶30时可获得最高的灵敏度。

2.3 质谱条件的选择

在选定的色谱条件下，采用ESI+电离方式对黄曲霉毒素B1进行检测。首先，在ESI+电离方式下对黄曲霉毒素B1进行全离子扫描，获得母离子为m／z313.1，然后确定其二级离子，其中丰度最高、分子质量较大的碎片离子m／z分别为241.0，269.0，285.1。以这3组碎片离子作为测定的特征目标监测离子，针对样品进行测定。结果表明，该组特征目标离子测定灵敏度高，选择性好，本底干扰物少，定量准确。

表1 黄曲霉毒素B1质谱参数

2.4 线性关系、回收率、精密度和检出限

选择稳定性较好、丰度大的离子(m／z分别为 313.0，241.0，269.0和 285.1)作为监测离子，使用MRM扫描方式。方法的回归方程为y= 57.584x+6.412 1，线性范围为0.2～60 μg／kg, 相关系数为0.997 5,检出限为0.02 μg／kg ,定量限为0.1 μg／kg。取玉米样品为空白,添加黄曲霉毒素B1后, 得到的UPLC–MS–MS结果如图1和2，测定结果列于表2。

从图2中看出，此方法黄曲霉毒素B1的响应值较好，而在子离子中241.0的响应值最好，适宜作为检测黄曲霉毒素B1的定量离子。表2中的数据表明，该法3个标准添加水平的回收率为83.8%～95.7%，相对标准偏差为2.5%～4.0%（n=6），精密度和准确度可满足农残分析需要。

表2 黄曲霉毒素B1的添加回收率和精密度

［1］杨惠芬，李明元，沈文.食品卫生理化检验标准手册［M］.北京：中国标准出版社，1998: 271–287.

［2］Stroka J. Development of a simplified densitometer for the determination of aflatoxins by thin-layer chromatography［J］. J Chromatogr A，2000 , 904: 263–268.

［3］American Public Health Association etc. Standard Methods For the Water and Wastewater［S］. 14th Edition1, Washington DC: 1979:5 321.

［4］Edinboro L E，Karnes H T. Determination of aflatoxin B1 in sidestream cigarette smoke by immunoaffinity column extraction coupled with liquid chromatography／mass spectrometry［J］. J Chromatogr A，2005，1 083(1–2): 127–132.

［5］谢光洪, 于光, 肖成蕊，等. 黄曲霉毒素B1免疫检测方法的新进展［J］. 中国畜牧兽医 , 2007, 34(7): 145–146.

［6］Ardic M，Karakaya Y，Atasever M，et al.Determination of aflatoxin B1 levels in deep-red ground pepper (isot) using immunoaffinity column combined with ELISA［J］. Food Chem Toxicol， 2008,46 (5): 1 596–1 599.

［7］Madalina Tudorache， Camelia Bala. Sensitive Aflatoxin B1 Determination Using a Magnetic Particles-Based Enzyme-Linked Immunosorbent ［J］. Assay Sensors, 2008(8): 7 571–7 580.

［8］Ferracane R, Tafuri A, Logieco A, et al. Simultaneous determination of aflatoxin B1 and ochratoxin A and their natural occurrence in Mediterranean virgin olive oil［J］. Food additives and contaminants, 2007，24 (2): 173–180.

［9］杨静,哈益明,王锋. 高效液相色谱–串联质谱法检测花生中的黄曲霉毒素 B1［J］.分析实验室，2009，28(6): 35–38.

Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry for Rapid Determination of A flatoxin B1 in Corn

Yu Chengguang
(Test Centre for Agriculture quality of Jinan, Jinan 250002, China)

Huang Hui
(CNGC Institue 53，Jinan 250031, China)

An analytical method for the determination of aflatoxin B1 in corn by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was developed. Sample pretreatment methods and depuration conditions were optimized. The detection limit of aflatoxin B1 was 0. 02 μg／kg. The recoveries were 83.8% – 95.7%.The results indicated that the method developed is simple, rapid, sensitive, which is suit for the analysis of aflatoxin B1 pesticides in corn.

aflatoxin B1; HPLC-MS／MS; corn

O657.7

A

1008–6145(2012)02–081–03

10.3969／j.issn.1008–6145.2012.02.025

联系人：于成广； E-mail: yucg1983@yeah.net

2011–12–14