黏附分子L1在胃肠道间质瘤中的表达及其临床意义

姜忠敏 成元华王淑妍

黏附分子L1在胃肠道间质瘤中的表达及其临床意义

姜忠敏 成元华△王淑妍

目的：探讨黏附分子L1在胃肠道间质瘤（GIST）中的表达情况及其临床意义。方法：采用免疫组织化学法和RT-PCR检测66例GIST、10例平滑肌肿瘤、6例神经鞘瘤及14例正常肠壁组织中L1的表达情况，并分析其临床意义。结果：胃肠道间质瘤中L1蛋白及mRNA的表达率分别为57.6%（38/66）和83.3%（30/36），差异有统计学意义（P<0.05）；L1在不同侵袭危险性GIST中的表达差异有统计学意义（P<0.05），但在不同性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型中的表达差异无统计学意义（P>0.05）。L1在GIST中的表达明显高于其在平滑肌肿瘤及正常肠组织中的表达（P<0.01），与其在神经鞘瘤中的表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论：L1表达在GIST发生发展过程中起促进作用，L1可作为GIST的诊断和鉴别诊断指标。

神经细胞黏附分子L1胃肠肿瘤 免疫组织化学 逆转录聚合酶链反应 胃肠道间质瘤

胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST）是一种特殊的间叶源性肿瘤，主要发生在胃肠道，也可发生在其他部位[1]。随着靶向药物的问世及其耐药普遍现象的发现，临床医生用药前要根据肿瘤的生物学行为对患者进行综合评估。目前GIST生物学行为评估主要根据GIST肿瘤体积大小和核分裂象的多少，然而近来发现直径很小的GIST也可能发生浸润和转移。因此寻找敏感、特异的标志物评估肿瘤的生物学行为显得尤为重要。由黏附分子介导的肿瘤细胞彼此之间的黏附力减弱和肿瘤细胞与基质的黏附力增强是近年来关于侵袭机制研究的热点，笔者对黏附分子L1在GIST中的表达情况进行分析，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集1995年1月—2008年1月贵阳医学院附属医院病理科初诊为胃肠道间叶源性肿瘤的蜡块共82例及相应正常肠切端14例，根据光镜下组织形态学特点及CD117、CD34、平滑肌肌动蛋白（SMA）、结蛋白（Desmin）及S-100蛋白免疫组化染色结果确诊GIST 66例、平滑肌肿瘤10例、神经鞘瘤6例。所有患者均经病理医生复查。每个肿瘤HE染色均经病理医生评估以下特征：组织类型、坏死、核分裂象（在400倍放大下观察50个视野）等。

1.2 主要试剂 鼠抗人单克隆L1抗体（Neomarker公司），Envision试剂盒及二氨基联苯胺（DAB）试剂盒（美国Dako公司），RT-PCR相关试剂（美国Promega公司）。光学显微镜（日本Olympus公司），ND-1000分光光度计（美国NanoDrop公司），低温高速离心机（德国Heraeus公司），梯度PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取 采用Trizol试剂一步法提取石蜡包埋组织中总RNA，采用分光光度计检测RNA溶液在280、260 nm波长下的光密度（OD），计算OD260/OD280的比值以验证RNA的纯度。

1.3.2 RT-PCR检测 L1 mRNA扩增引物参考文献[2]设计，由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物5'-TT⁃GGGAGAAGAGAAGGGT-3'，下游引物 5'-TGAAGCAGAG⁃GATGAGCA-3'，扩增片段长度268 bp；以β-actin为内参照，上游引物5'-TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3'，下游引物5'-GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC-3'，扩增片段长度396 bp。逆转录反应体系20 μL，扩增条件为94℃1 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，94 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40个循环，然后72℃7 min做终延伸。取PCR产物5 μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外线灯下观察电泳条带并进行分析。位于268 bp和396 bp上的条带分别为L1和β-actin mRNA的扩增片段，如在268 bp出现扩增片段则判断L1 mRNA阳性表达，否则为阴性。

1.3.3 免疫组化染色 采用Envison两步法：取上述存档的石蜡组织块，连续组织切片，厚4 μm，常规HE染色及免疫组化染色。免疫组化染色按试剂盒说明书操作。用已知阳性片和PBS代替一抗分别作为阳性和阴性对照。L1以胞膜及胞浆内呈棕黄色细颗粒为阳性。由两名病理医师独立观察，选染色均匀肿瘤区10个高倍视野，以阳性细胞所占的百分比计分：无阳性细胞记0分；阳性细胞率<25%记1分；阳性细胞率26%~50%记2分；阳性细胞率＞51%记3分。

1.3.4 GIST生物学行为评价 按Fletcher等[3]推荐的GIST生物学行为评价表进行分组，66例GIST可分为极低、低、中和高度侵袭危险性4组。1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用ANOVA单因素方差分析，组间多重比较采用q检验；计数资料采用例（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GIST中L1蛋白表达情况及与临床病理特点之间的关系 随着GIST侵袭危险性增加，L1表达率也明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。不同性别、年龄组、肿瘤部位和组织学类型间比较，L1表达差异无统计学意义（均P>0.05），见表1。

Table 1 The relationship between the expression of L1 and clinicopathologic features in GIST表1 GIST中L1表达情况与临床病理特点的关系 例（%）

2.2 L1在GIST、平滑肌肿瘤、神经鞘瘤及正常肠壁组织中的表达 L1蛋白在GIST中的阳性表达率高于胃肠道平滑肌肿瘤及正常肠壁组织中的表达，差异均有统计学意义（P<0.01），与其在神经鞘瘤中的表达相比，差异无统计学意义（P>0.05），见表2、图1。

Table 2 The expression of L1 in GIST,smooth muscle tumor,schwannoma and the normal bowel tissue表2 L1在GIST、平滑肌肿瘤、神经鞘瘤及正常肠壁组织中的表达情况 例（%）

2.3 石蜡包埋组织中RNA提取的结果 从66例石蜡包埋的GIST标本中提取总RNA，其中40例提取成功。测定总RNA的OD260/OD280比值为1.67±0.17，RNA浓度为（1.58±0.75）mg/L。凝胶电泳明显可见28 S、18 S及5 S核糖体RNA条带，28 S与18 S比值接近于2，说明样品RNA未完全被降解，见图2。

2.4 GIST中L1 mRNA及蛋白的表达情况 40例GIST中只有36例扩增成功，其中L1 mRNA阳性表达率为83.3%（30/36），高于L1蛋白表达[57.6%（38/66）]，差异有统计学意义（χ2=6.955，P<0.01）。L1 mRNA在极低、低、中、高度侵袭危险性不同组中的表达差异有统计学意义（P<0.05），其中低度与中度组间L1 mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05），其余组间比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表3、图3。

Table 3 The comparative analysis of L1 mRNA expression in different aggressive risk groups表3 L1 mRNA表达在不同侵袭危险性组间比较

3 讨论

神经细胞黏附分子L1（CD171）于20世纪80年代被发现具有促进神经再生作用，能介导神经细胞之间的黏附，在神经轴突的生长、聚集，神经细胞的转移，纤维髓鞘的形成，神经通路的构建及信号的转导等方面具有非常重要的作用[4]。最初认为，L1只表达于神经系统，后来研究发现其在多种不同来源的肿瘤如膀胱癌[4]、乳腺癌[5]、胰腺癌[6]、结直肠癌[7]等组织中过表达，且与肿瘤的浸润、进展及预后密切相关。因此，L1成为多种肿瘤诊断、鉴别诊断、生物学行为评估、预后判断及靶向治疗的有用指标之一。Kaifi等[8]用免疫组化法首次检测到L1在GIST中高表达，表达率为74%（53/72），但在胃肠道平滑肌肿瘤和纤维瘤病中不表达。Zander等[9]在GIST患者血液中检测到L1，且可溶性L1浓度与患者的预后密切相关。但在国内还少见相关报道。

本研究显示GIST组织中L1蛋白表达阳性率为57.6%。RNA提取成功的GIST中L1 mRNA的表达率为83.3%，高于L1蛋白表达率，该差异的产生可能是由于：（1）L1与去整合素-金属蛋白酶10（adis⁃integrin and metalloprotease,ADAM10）同时存在于肿瘤组织中，ADMA10能促使L1从肿瘤细胞膜上脱落，从而影响L1的检出率[10]。（2）由于组织经福尔马林固定后，细胞表面蛋白发生交联，结构发生改变，以致不能和相应抗体结合。因此笔者认为GIST中检测L1 mRNA更敏感，有助于提高GIST诊断的准确性。L1表达存在一定的特异性，在正常组织及最易与GIST混淆的胃肠道平滑肌肿瘤中均呈阴性表达，提示L1在GIST的诊断以及与消化道平滑肌源性肿瘤的鉴别中有重要参考价值。L1在不同侵袭危险性GIST组间的表达水平有明显差异，随侵袭危险性的升高，其表达阳性率和表达强度依次升高，此结果与Kaifi等[8]的研究结果相似，提示L1可以作为预测GIST生物学行为的参考指标。

[1]Paral J,Slaninka I,Kalabova H,et al.Gastrointestinal stromal tu⁃mors:review on morphology,molecular pathology,diagnostics,prog⁃nosis and treatment options[J].Acta Gastroenterol Belg,2010,73(3):349-359.

[2]Laifenfeld D,Karry R,Klein E,et al.Alterations in cell adhesion mol⁃ecule L1 and functionally related genes in major depression:a post⁃mortem study[J].Biol Psychiatry,2005,57（7）：716-725.

[3]Fletcher CD,Beman JJ,Corless C,et al.Diagnosis of Gastrointestinal stromal tumors:a consensus approach[J].Hum Pathol,2002,33（5）:459-465.

[4]Jung J,Son YS,Park H,et al.The cell adhesion molecule L1 pro⁃motes gallbladder carcinoma progression in vitro and in vivo[J].On⁃col Rep,2011,25(4):945-952.

[5]Li Y,Galileo DS.Soluble L1CAM promotes breast cancer cell adhe⁃sion and migration in vitro,but not invasion[J].Cancer Cell Int,2010,10:34-39.

[6]Tsutsumi S,Morohashi S,Kudo Y,et al.L1 Cell adhesion molecule(L1CAM)expression at the cancer invasive front is a novel prognos⁃tic marker of pancreatic ductal adenocarcinoma[J].J Surg Oncol,2011,103(7):669-673.

[7]Kajiwara Y,Ueno H,Hashiguchi Y,et al.Expression of l1 cell ad⁃hesion molecule and morphologic features at the invasive front of colorectal cancer[J].Am J Clin Pathol,2011,136(1):138-144.

[8]Kaifi JT,Strelow A,Schurr PG,et al.L1(CD171)is highly ex⁃pressed in gastrointestinal stromal tumors[J].Mod Pathol，2006,19(3):399-406.

[9]Zander H,Rawnaq T,von Wedemeyer M,et al.Circulating levels of cell adhesion molecule L1 as a prognostic marker in gastrointesti⁃nal stromal tumor patients[J].BMC Cancer,2011,11(1):189-196.

[10]Gutwein P,Mechtersheimer S,Riedle S,et al.ADAM10-mediated cleavage of L1 adhesion molecule at the cell surface and in re⁃leased membrane vesicles[J].Faseb J,2003,17(2):292-294.

Expression and Clinical Significance of Adhesion Molecule L1 in Gastrointestinal Stromal Tumors

JIANG Zhongmin,CHENG Yuanhua,WANG Shuyan

Department of Pathology,Tianjin Fifth Central Hospital,Tianjin 300450,China

Objective:To investigate the expression of the adhesion molecule L1 in gastrointestinal stromal tumors(GIST),and the clinical significance thereof.Methods:The expression levels of L1 were detected in tissues of 66 samples of GIST,10 samples of smooth muscle tumors,6 samples of schwannoma and 14 samples of normal bowel by immunohistochem⁃istry and RT-PCR,and their clinical significances were analyzed.Results:The expression rates of L1 protein and mRNA in GIST were 57.6%(38/66)and 83.3%(30/36),which were significantly different between two groups(P<0.05).The L1 expres⁃sion was significantly different in the different aggressive risk of GIST(P<0.05),but there was no significant difference in dif⁃ferent age,gender,tumor locus and tissue type groups(P>0.05).The expression of L1 was significantly higher in GIST than that of smooth muscle tumor and normal bowel tissues(P<0.01).There was no significant difference in the expression of L1 between GIST group and schwannoma groupss(P>0.05).Conclusion:The expression of L1 may play an important role in tu⁃morigenesis and progression of GIST,which suggest that L1 can be applied to diagnosis or differential diagnosis of GIST.

neural cell adhesion molecule L1 gastrointestinal neoplasmsimmunohistochemistryreverse transcrip⁃tase polymerase chain reaction gastrointestinal stromal tumors

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.010

300450天津市第五中心医院病理科（姜忠敏）;贵阳医学院附属医院病理科（成元华,王淑妍）

△通讯作者 E-mail：chengyuanhua@163.com

（2011-07-19收稿 2012-02-07修回）

（本文编辑 李鹏）