人晶状体细胞膜衰老模型的建立△

竺向佳 叶鸿飞 卢奕

膜磷脂分子的运动主要有4种方式：侧向扩散、旋转运动、伸缩运动及翻转扩散(又称为翻转)。当脂质双分子层内的水分子通透性改变时，膜磷脂排列的疏密性和有序性会受到显著影响，磷脂分子的运动性发生改变，进而影响整个细胞膜的流动性。6-酰基-2-二甲氨基萘(6-dodecanoyl-2-dimethylaminonaphthalene,Laurdan)是一种对细胞膜水分子通透性改变非常敏感的探针，可以把膜流动性的改变用不同波长下测得的荧光强度比例，即总极化(generalized polarization，GP)值来定量体现[1]。GP值越小，细胞膜流动性越强。

关于晶状体的细胞膜流动性，既往研究有限，多数通过观察某个影响膜流动性的因素，间接评估整个细胞膜的流动性，具有一定的局限性。我们的前期研究[2]利用人晶状体组织，通过Laurdan染色和双光子共聚焦显微镜观察，结合ImageJ和Photoshop图像分析，实现了对晶状体不同区域细胞膜流动性的定点和定量分析，是一种全新的研究方法，反映了整个细胞膜的状态。利用该方法，我们对晶状体细胞膜流动性的年龄相关性改变，进行了年龄层次跨度较大的研究。结果发现，年轻晶状体从内到外各区域的细胞膜流动性几乎恒定；随年龄的增长，晶状体中央部分的细胞膜流动性不断增加，而距中心3.5 mm以外最新合成的皮质区域细胞膜流动性却保持恒定。那么这种晶状体细胞膜的年龄相关性改变能否通过某种模型来模拟呢？

Heys等[3]将完整的晶状体置于50 ℃温和热应激下，以模拟晶状体在35 ℃体温长期作用下发生的年龄相关性改变。该模型表现为晶状体内可溶性晶状体蛋白(α、β、γ)的含量下降，α晶状体蛋白高分子量(high molecular weight,HMW)的形成继而下降，以及晶状体硬度增加，因此是一个较理想的体外实验模型。本研究的主旨则在于阐明晶状体加热模拟晶状体细胞膜年龄相关性改变的可行性。

1 材料与方法

1.1 人晶状体获取 人晶状体由Lions NSW眼库(悉尼，澳大利亚)提供，3对(年龄分别为30、41、63岁)，于捐献者死亡后3～14 h内取出，迅速置入-80 ℃冰箱保存。人体标本的使用遵从赫尔辛基宣言，并获得悉尼大学人体研究伦理委员会批准(批准号：# 7292)。

1.2 完整晶状体加热 于3对晶状体中每对各取1个，置于15 mL离心管制成的湿润容器中，密封后置于50 ℃烘箱内加热20 h(图1A)。

1.3 冷冻切片制作 将3对晶状体(加热及未加热)全部行冷冻切片(Leica公司,德国)。方法如下：虹膜面朝下，将晶状体用最佳切削温度包埋剂包埋并固定于标本盘上，制作厚度为10 μm的完整冠状切片；取晶状体中间部分的切片并按顺序标记，室温下放置1 h后于-20 ℃保存备用。

1.4 Laurdan染色 将4 μL Laurdan (Invitrogen公司,澳大利亚)加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)中，制备成50 μmol/L溶液。每张切片滴入40 μL Laurdan溶液，室温避光放置30 min，PBS冲洗3次后沥干；滴入40 μL 4%多聚甲醛，室温避光固定20 min，PBS冲洗3次，擦干标本周边液体，封片后室温避光过夜，4 ℃保存。

图1. 加热模型及图像采集处理方法示意图

A.取15 mL离心管制成湿润容器，加入100 μL水以防蒸干；B.图像采集示意图，图中大椭圆形为晶状体的冠状切片，小方形为每个视野采集的图像，连续采集775×775 μm2的数帧图像，每张图像边缘部分重叠，直至覆盖整个切片的长轴；C.1和2为同一个视野2个通道的信号强度图像，3和4为经软件转换后的GP图像和HSB图像；D.用Photoshop软件测量距离切片中心(M点)0、0.75、2、3、3.5、4、4.5 mm 各位点处的GP值，各位点均测量3次，每个晶状体选取3张连续切片

1.6 晶状体切片加热 另取2个晶状体(年龄分别为28和47岁)，冰冻切片步骤同前；各取中央部位3张切片置于密封湿盒，于50 ℃烘箱加热20 h；取3张未加热的中央区切片。对所有切片进行Laurdan染色，行图像采集分析及GP值计算。

2 结果

对于每对完整的晶状体(30、41、63岁)，经50 ℃加热20 h的一侧晶状体较未加热的对侧晶状体，距中心3.5 mm范围内的GP值均明显下降(图2)，而3.5 mm以外区域的GP值基本不变。纵向对比3对不同年龄的晶状体，可见3.5 mm内的GP值随年龄增长呈明显下降趋势。HSB图像颜色变化可反映GP值的变化，黄至红色表示GP值较高，细胞膜流动性较差；绿色者则GP值较低，细胞膜流动性较好。对比每对晶状体的HSB图像，发现加热的晶状体较未加热的晶状体图像表现有显著差异；经加热的30岁晶状体与未加热的41岁晶状体表现相似，而经加热的41岁晶状体与未加热的63岁晶状体更为相似(图3)。

图3. 不同年龄的晶状体经50 ℃ 20 h加热者和未加热者晶状体GP值改变的HSB图像

GP值越小，颜色越偏绿，细胞膜流动性越强

对于28岁及47岁的晶状体切片，其HSB图像可见加热后晶状体切片内部区域偏向于绿色(图4)。分析GP值后发现，经50 ℃加热20 h后距中心3.5 mm范围内的GP值明显下降(图5)，3.5 mm以外范围的GP值基本不变。

图4. 28岁和47岁的晶状体切片经50 ℃ 20 h加热者和未加热者晶状体GP值改变的HSB图像

GP值越小，颜色越偏绿，细胞膜流动性越强

3 讨论

细胞膜的流动性是指构成细胞膜的脂质和蛋白质分子的运动性，主要表现为膜磷脂分子的运动。磷脂双分子层构成了细胞膜的基本支架，其轻油般的液态结构具有流动性，这种流动性可以反映细胞膜的功能状态及膜受损伤程度[4]。流动性不仅是细胞膜的基本特性之一，也是细胞进行生命活动的必要条件，参与细胞的信号转导、膜的融合、胞吞作用及膜结合酶功能的维持等。

当细胞膜的结构变得疏松时，更多的水分子通透入脂质双层结构，使其极性升高。这一特性可通过发射光谱为溶剂极性依赖的荧光探针检测出，用以评估膜致密程度的改变。Laurdan即为此类探针，可插入细胞膜内，与磷脂分子的疏水端平行排列。它的定位和发射光谱不受磷脂头基和表面修饰的影响，通过检测水分子通透的变化以体现整个细胞膜的疏密程度和流动性[5]。Bagatolli等[6]利用膜结构内水分子通透改变时Laurdan表现的发射光谱红移或蓝移特性，总结得到GP值的计算公式，为细胞膜流动性的进一步量化提供了基础。

我们的前期研究[2]利用Laurdan染色来观察人的晶状体组织切片，通过GP值计算，可以实现对整个晶状体细胞膜流动性的定点和定量分析。观察22～83岁的23对晶状体切片，发现在20～40岁的晶状体中，从外到内的细胞膜流动性几乎恒定。随着年龄的增长，距离晶状体中心约3.5 mm半径范围内的细胞膜流动性不断增加，距中心越近越明显；而3.5 mm以外即新合成的皮质区域内，细胞膜的流动性几乎保持不变[2]。但是这种现象尚无有效的模型来重现。

Heys等[3]研究表明，随着年龄增长，晶状体中各种可溶性晶状体蛋白含量逐渐下降；30岁以后，大部分游离α晶状体蛋白开始聚集为α晶状体蛋白HMW，后者进一步变性，溶解度下降并沉淀。该作者还发现，经50 ℃温和热应激的完整晶状体也会出现细胞内可溶性晶状体蛋白(α、β、γ)含量下降，HMW形成并最终变性，以及晶状体硬度增加等类似于年龄相关性的晶状体改变[7]。因此认为，可用50 ℃加热晶状体的方法，研究晶状体长时间在体温作用下发生的年龄相关性改变。

本研究对晶状体进行了加热，旨在阐明其模拟晶状体细胞膜年龄相关性改变的可行性。结果显示，加热后30岁晶状体的HSB图像与未加热41岁晶状体表现相似，而加热后41岁晶状体与未加热63岁晶状体表现类似；测量GP值后发现，加热后晶状体中央3.5 mm内的细胞膜流动性明显增加，与前期年龄相关性研究中观察到的膜流动性改变一致，且两者的GP值改变具有可比性，进一步说明了长时期处于35 ℃的体温环境可能是晶状体衰老的重要原因之一。

需要指出的是，冷冻后的晶状体脆性增加，行冷冻切片时较困难，靠近周边的组织易发生卷曲或碎裂，导致组织损失。本实验中，63岁晶状体切片距中心4.5 mm的组织完整，而其他年龄晶状体距该位点处组织已发生损失，因此仅得到4.0 mm以内各处的相应数据。

此外，我们还进行了单独晶状体切片的温和热应激实验，结果同样发现50 ℃加热20 h后28岁和47岁的晶状体切片，尤其是距离中心3.5 mm范围内均出现了GP值下降，即细胞膜流动性增加，这也与年龄相关性改变相符。另外,由于单个晶状体可以制作多个切片，且切片的加热过程更为简单，在晶状体来源有限的条件下，可以有效节约标本资源。

同时，50 ℃加热温度与晶状体所处的某些实际环境差别并不大。例如，将猴子暴露于49 ℃中午阳光下，晶状体的温度可以在9 min内达到41.5 ℃[8]。膜脂质本身在这一温度下的改变似乎并不是观察到的细胞膜流动性增加的原因，因为在其他的实验中发现，即便把晶状体在70 ℃加热20 h，也未观察到明显的膜磷脂变化。

值得注意的是，无论是完整晶状体还是晶状体切片，加热与未加热者细胞膜流动性的变化均以距晶状体中心3.5 mm区为界，可能与该位置的屏障作用有关。有研究[9-10]显示，该屏障的作用自中年开始逐渐明显，阻碍小分子物质如谷胱甘肽等抗氧化物在晶状体核区及皮质区之间的流通，促使该区域内部的晶状体核相关蛋白发生翻译后修饰[11]，可能为年龄相关性核性白内障的发生机制提供依据[12]。

综上所述，晶状体50 ℃加热是模拟晶状体细胞膜流动性年龄相关性改变的有效模型，可以很好地用于今后晶状体细胞膜流动性方面的研究。

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