氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定*

丁正中， 张 璐， 李 涛

(1．浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004;2．艾青中学，浙江金华 321015)

氧化还原因子-1(Ref-1)是哺乳动物细胞中重要的双功能蛋白，在DNA损伤修复及抗氧化防御屏障中发挥着关键作用．Ref-1由318个氨基酸残基构成，分子量约为37 kD，包含2个主要功能域．Ref-1的C端功能区进化高度保守，约157个氨基酸，具有核酸内切酶活性．离子辐射、活性氧(radical oxygen substrates，ROS)和烷化剂等可引起DNA损伤，造成脱嘌呤/脱嘧啶位点(apurinic/apyrimidinic sites，AP 位点)．Ref-1是 AP 位点碱基切除修复(base excision repair，BER)途径中主要的限速酶［1］．如果Ref-1的这一功能缺陷，将造成AP位点累积，诱导细胞凋亡．放射治疗、烷化剂及核苷酸类似物药物(如:博莱霉素、替莫唑胺、吉西他滨等)均可显著增强Ref-1蛋白表达，是肿瘤细胞产生获得性耐药，最终导致药物失敏的重要机制［2-4］．

Ref-1独特的亲水性N末端由约127个氨基酸组成，种属差异较大，该段序列赋予Ref-1氧化还原酶活性．氧化损伤造成半胱氨酸巯基发生二硫键交联、S-硝基化、谷胱甘肽化．通过还原半胱氨酸残基，Ref-1能回复氧化损伤蛋白的功能活性．Ref-1能显著促进许多转录因子的激活并提高它们的DNA结合能力，这代表了信号转导中一种新型的氧化还原调控模式，对真核基因表达意义重大［5］．氧化应激条件下，Ref-1表达增高或磷酸化活化，引起参与氧化还原调节的激活蛋白-1(AP-1)等转录因子活性变化，进而引起下游靶基因的活化，使一些对细胞具有保护作用的蛋白得到表达．因此，抑制Ref-1氧化还原酶活性，亦能促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤增殖．

Ref-1的高表达、活性增高及亚细胞定位改变与多种肿瘤的发生有关，并关系到肿瘤的恶性程度以及放化疗的敏感性［6-8］．如何抑制Ref-1的表达或活性，是目前肿瘤靶向治疗的重要课题．本实验通过原核表达纯化人源Ref-1蛋白，建立了其活性检测体系，为进一步研究Ref-1蛋白的功能、筛选Ref-1特异性抑制剂建立前期基础．

1 材料与方法

1．1 材料

菌株BL21(DE3)和质粒pGEX-4T-3为浙江师范大学动物生理实验室保存．pRc/RSV-Ref-1质粒由日本名古屋大学Fukushi Kambe教授惠赠．

1．2 原核表达载体的构建

HindⅢ和XbaⅠ双酶切将Ref-1编码片段从pRC/RSV真核表达载体中释放出来，插入pBluesciptⅡ SK(+)相应位点．pBluesciptⅡSK(+)/Ref-1质粒经SalⅠ和NotⅠ双酶切释放Ref-1编码片段，插入pGEX-4T-3相应位点，完成Ref-1原核表达载体的构建．挑取单克隆进行酶切鉴定，并由北京奥科公司测序，确定基因正确插入且无突变．

1．3 GST-Ref-1融合蛋白的表达

重组质粒转化感受态细菌BL21，挑克隆，在含氨苄西林(Amp)的LB培养基上摇菌过夜．将50 mL培养液扩大培养至1 000 mL LB培养液中220 r/min培养2～4 h，使 A600=0．6，降低温度至30℃，加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0．4 mmol/L，摇菌4～6 h．收集菌液，每1 000 mL细菌用40 mL磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，冰上超声直至液体不再混浊，4℃，14 000 r/min离心20 min，收集上清液．分别取诱导前后的培养液及超声离心后的上清液和沉淀，加入2×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，煮沸后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，分析融合蛋白的表达情况．

1．4 GST-Ref-1融合蛋白的纯化

加1 mL 50%谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepharose 4B)溶液至超声后的上清液中，室温下垂直混悬器混悬结合过夜，4℃，500 r/min离心5 min后，收集珠子，预冷的1 mL磷酸盐缓冲液洗5遍，离心后收集珠子，加1 mL 10 mmol/L还原型谷胱甘肽洗脱缓冲液，垂直混悬器轻轻混悬20 min，4 ℃，500 r/min离心5 min，吸出上清液置新管中．再重复洗涤3次，分别收集上清液．

将上清液收集入透析袋，4℃透析3次，每4 h更换透析液(PBS)，聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩至1 mL，加入终含量为10%的甘油，含0．5 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，－80℃保存．纯化后的蛋白进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色检测条带．谷胱甘肽巯基转移酶(GST)按上述方法表达纯化．

1．5 蛋白质印迹(Western blot)

分别取10 μL纯化的GST-Ref-1及GST进行SDS-PAGE分析，湿式电转化转膜．以兔源Ref-1抗体为一抗，辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔抗体为二抗，用电化学发光(ECL)显色试剂盒显影曝光，鉴定表达产物．

1．6 GST-Ref-1氧化还原酶活性的检测

应用凝胶阻滞法检测GST-Ref-1氧化还原酶活性．按文献方法提取HeLa细胞核蛋白，建立体外反应体系［9-10］．北京奥科公司合成转录因子AP-1特异识别的双链探针，正链序列为5'-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3'．T4多聚核苷酸激酶对探针进行末端32P标记．在每组反应混合物中，核蛋白用量为40 μg，GST-Ref-1的用量是400 ng．核蛋白与GST-Ref-1体外混匀后，用终浓度为20 mmol/L的H2O24℃处理15 min后，用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示AP-1蛋白与探针DNA结合条带．

2 结果与分析

图1 质粒酶切鉴定图

2．1 Ref-1原核表达载体的构建及鉴定

Ref-1原核表达载体的构建流程如下:首先，用HindⅢ和XbaⅠ双酶切将Ref-1编码片段从测序正确的pRC/RSV真核表达载体中释放出来，之后将Ref-1编码片段插入pBluesciptⅡ SK(+)相应位点，经鉴定2－4泳道的克隆均为正确插入目的基因的重组质粒(见图 1(a));接着，用SalⅠ和NotⅠ双酶切释放约1 kb的Ref-1编码片段，插入pGEX-4T-3相应位点，从而完成GSTRef-1原核表达载体的构建，经鉴定8泳道的克隆为目的重组质粒(见图1(b))．图1中酶切出现1 kb左右的条带，说明获得了Ref-1编码片段．测序结果表明，pGEX-4T-3/Ref-1质粒构建正确，读码框无移码，无碱基错配．

2．2 GST-Ref-1融合蛋白的原核诱导表达

将pGEX-4T-3/Ref-1质粒转入BL21(DE3)菌株，IPTG诱导表达外源基因．为了能够检测融合蛋白的表达效率及其可溶性，分别取诱导前后的菌体及裂菌后的上清液、沉淀，同时进行SDSPAGE，对凝胶进行考马斯亮蓝染色，分析蛋白条带．如图2所示，GST-Ref-1蛋白得到了有效的表达，2号孔为诱导后蛋白电泳条带，在65 kD左右出现明显的诱导条带，符合理论预期．并且，GSTRef-1蛋白的表达性质基本为可溶性表达，3号孔为上清液样品，可发现其中含有大量的GST-Ref-1融合蛋白．这些证据表明GST-Ref-1原核表达成功，并且基本为可溶性表达，极有利于下一步的纯化操作及后续研究．

图2 GST-Ref-1融合蛋白诱导表达图

2．3 GST-Ref-1融合蛋白的亲和纯化

采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B珠子亲和富集GST-Ref-1融合蛋白，再用10 mmol/L还原型谷胱甘肽洗脱GST-Ref-1融合蛋白，分别流洗4次，每个批次的洗脱液取10 μL做SDS-PAGE染色，如图3所示，GST-Ref-1融合蛋白得到了有效的亲和纯化，并以第2次流洗的效率最高．Science lab软件灰度扫描，得出纯化蛋白的纯度为92%．对纯化的GST-Ref-1融合蛋白进行透析去除谷胱甘肽，PEG8000浓缩后加甘油冻存于－80℃冰箱中．

图3 GST-Ref-1融合蛋白亲和纯化后产物的电泳图

为了计算融合蛋白的诱导效率及亲和纯化的蛋白得率，实验中对每次保留的蛋白都进行了BCA法蛋白定量．首先通过Science lab软件灰度扫描分析，得出诱导后GST-Ref-1融合蛋白占菌体蛋白的比率为21．5%．再经BCA法蛋白定量，得出经亲和纯化浓缩后的GST-Ref-1融合蛋白占诱导后原始菌体的比率为6．8%，占超声裂解后上清液中蛋白的比率为11．7%．

2．4 蛋白质印迹(Western blot)检测

蛋白质印迹检测验证GST融合蛋白是否为表达序列正确的Ref-1蛋白．如图4所示，只有GST-Ref-1条带位置能检测到强化学发光信号，而对照GST条带无发光信号．表明GST-Ref-1原核表达质粒能够正确表达Ref-1融合蛋白，具有良好的抗原性．

图4 GST-Ref-1融合蛋白纯化终产物PAGE考马斯亮蓝染色及蛋白质印迹检测

2．5 GST-Ref-1蛋白活性的检测

许多转录因子受到Ref-1氧化还原调控，如AP-1，NFκB，CREB，ATF，NF-Y 和 p53 等，Ref-1 能直接增强转录因子的DNA结合能力．为了验证GST-Ref-1融合蛋白是否具备活性，通过凝胶阻滞实验对其氧化还原酶活性进行了检测．结果如图5所示:GST-Ref-1直接增强了AP-1与靶DNA的结合量，而GST蛋白本身对AP-1的DNA结合能力无影响，表明GST-Ref-1融合蛋白能增强AP-1的DNA结合能力;同时，H2O2抑制了AP-1与探针的结合，但同时加入GST-Ref-1蛋白能部分恢复AP-1的DNA结合活性．表明GST-Ref-1融合蛋白具有氧化酶活性．

图5 凝胶阻滞法检测GST-Ref-1融合蛋白氧化还原酶活性

3 讨论

本实验采用pGEX-4T-3载体系统，通过IPTG诱导表达，获得了GST-Ref-1融合蛋白的可溶性表达，并进行了亲和纯化，蛋白在菌体中未出现明显的降解．该系统有利于GST-Ref-1融合蛋白的可溶性表达与亲和纯化，纯化条件温和、步骤简单，同时能极大限度地保持融合蛋白的空间结构和免疫原性，有利于下一步实验操作．本实验所获得的GST-Ref-1融合蛋白，可用于抗体制备，利用GST pull-down实验揭示 Ref-1互作蛋白，筛选Ref-1蛋白抑制剂．

Ref-1是重要的抗氧化基因，亦是重要的肿瘤耐药基因．Ref-1具有AP内切酶活性，可修复放射、烷化剂、氧化应激造成的DNA损伤;同时其所具有的氧化还原酶活性能调控大量转录因子的活性，上调 Bcl-2等抗凋亡基因的表达．Robertson等［11］首先发现，在宫颈癌、睾丸癌中Ref-1过表达可增强其对博来霉素和射线的抵抗．Fishel等［12］研究发现，Ref-1在卵巢肿瘤中高表达，如利用siRNA技术将其沉默掉，肿瘤体积明显缩小，细胞增殖减慢，阻滞于细胞周期S期．王东研究组［13］构建了Ref-1的RNAi质粒，转染骨肉瘤细胞系9901，发现抑制Ref-1表达能够下调血管来源的生长因子(VEGF)表达，抑制肿瘤微血管的形成，同时提高了骨肉瘤细胞放疗的敏感性．Ref-1还能诱导肿瘤细胞的多药耐药性．近期研究发现，Ref-1调控转录因子 YB-1，从而诱导多药耐药基因MDR1的表达［14］．MDR1基因编码跨膜蛋白 P-糖蛋白，P-糖蛋白为药物泵，通过三磷酸腺苷(ATP)提供能量，可将药物泵出细胞外，使其细胞毒作用减弱直至丧失，出现耐药现象．因此，Ref-1是肿瘤治疗的重要靶向分子．

研究者开发了多种药物试图封闭Ref-1的表达或活性［15-17］．第1类为AP内切酶活性抑制剂，主要有7-硝基吲哚-2-甲酸、CRT0044876、硫蒽酮和甲氧胺;第2类为氧化还原酶活性抑制剂，如E3330和白藜芦醇，此类抑制剂往往同时抑制活性氧通路及NFκB的活化，效应相对较广;第3类则是能够抑制Ref-1表达的化学物质，如大豆异黄酮．

本实验表达的GST-Ref-1融合蛋白，经体外凝胶阻滞实验发现具有氧化酶活性，能直接增强AP-1的DNA结合能力，并能抑制H2O2对AP-1蛋白的损伤．如何构建合适的药物筛选体系，检验药物对Ref-1 AP内切酶及氧化还原酶活性的影响，将是一个有意义的研究方向．

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