Epo／Epo-R在非小细胞肺癌中的表达和MVD关系及意义

唐 甜 陕 光

Epo／Epo-R在非小细胞肺癌中的表达和MVD关系及意义

唐 甜 陕 光1＊

（武汉大学人民医院肿瘤Ⅱ科，1武汉大学人民医院泌尿Ⅱ科 湖北430060）

目的 探讨Epo／Epo-R在非小细胞肺癌中的表达和肿瘤微血管密度（MVD）关系及意义。方法 收集武汉大学人民医院病理科2008-2010年非小细胞肺癌存档蜡块40例（男28例，女12例），采用免疫组织化学S-P法检测40例非小细胞肺癌及癌旁组织中Epo／Epo-R的表达水平，并采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对Epo／Epo-R的表达进行定量分析，用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK（q）检验。同时检测肿瘤微血管密度（MVD），分析与临床病理之间的关系。结果 Epo／Epo-R在非小细胞肺癌中的表达明显高于癌旁组织。图像分析结果显示：两组间差异有显著性意义（P＜0.05）。Epo／Epo-R表达阳性组织中，MVD计数显著高于Epo／Epo-R表达阴性者（P＜0.05）。结论 Epo／Epo-R在非小细胞肺癌中呈高表达，并与微血管密度（MVD）密切关系，联合检测Epo／Epo-R和MVD更有利于正确判断疾病的临床病理特征及其预后。

非小细胞肺癌；Epo／Epo-R；MVD；免疫组织化学

肺癌是临床常见的恶性肿瘤，现已成为人类癌症死亡的最主要原因之一。肺癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤，并且仍有上升的趋势，是对人体健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一［1］。

红细胞生成素（erythropoietin，EPO）和红细胞生成素受体（erythropoietin recep tor，EPOR）是调节红系祖细胞增殖、分化和生存所必需的关键细胞因子。近年来，国内外研究进一步发现，EPOR不仅存在于幼红细胞，在其它细胞也有发现，如神经系统、心血管系统、内皮细胞、胰腺、肺、肝脏、肾脏、子宫、实质瘤等也有EPOR的表达。近年来大量的研究发现EPO具有抗炎、抗凋亡、神经保护等非促红细胞生成作用。但也有人认为Epo有可能直接或间接导致肿瘤细胞生长而促进疾病进展，而这与 Epo-R 有关［2］。

本文采用免疫组化和图像分析方法检测和分析了肺癌组织中Epo／Epo-R的表达和肿瘤微血管密度（MVD）关系，为肺癌的诊断和治疗提供理论依据。

材料和方法

1.材料

病例资料和分组

收集武汉大学人民医院2008-2010年临床手术切取（病理切片诊断）的非小细胞肺癌40例，另取瘤组织周围正常肺组织5例作对照。其中男28例，女12例，年龄58-76岁，中位年龄60.5岁。组织学分类：腺癌20例，鳞癌16例，腺鳞癌4例。病理分级：Ⅰ级（高分化）13例，Ⅱ级（中分化）18例，Ⅲ级（低分化）9例。临床分期（TNM分期）：Ⅰ期13例，Ⅱ期20例，Ⅲ期7例。所有病例术前均未行放、化疗。

2.方法

2.1 HE染色 常规取材、固定、脱水、透明、包埋、切片、HE染色及封片。

2.2 免疫组织化学SP法检测Epo／Epo-R和第Ⅷ因子相关抗原

具体步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；抗原修复（柠檬酸缓冲液微波抗原修复法），室温自然冷却后，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗5×3min；滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景；甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间（约3-5min），自来水冲洗终止反应；苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检；用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为Epo／Epo-R的阳性对照组。

3.免疫组织化学结果判断

Epo／Epo-R以细胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，Ⅷ因子相关抗原以胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对Epo／Epo-R的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积／单位面积中细胞的总面积×100%）。MVD测定：以内皮细胞核出现棕黄色颗粒为微血管密度区，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400）计数肿瘤组织中与临近微血管。结果以5个视野血管的均数表示。

4.统计学处理

对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和Spearman等级相关分析。

结 果

1.EPO的表达 非小细胞肺癌胞膜及胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒，EPO呈阳性表达（图1）；癌旁组织细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，EPO呈阴性表达（图2）。图像分析结果见表1，经单因素分析非小细胞肺癌与癌旁组织比较，差异有显著性（P＜0.05）。见表1。

表1 非小细胞肺癌和癌旁组织中EPO表达的平均光密度和阳性面积率（¯x±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of EPO in NSCLC and cancer side tissue（¯x±s）

2.Epo-R的表达 非小细胞肺癌胞膜及胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒，Epo-R呈阳性表达（图3）；癌旁组织细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，Epo-R呈阴性表达（图4）。图像分析结果见表2，经单因素分析非小细胞肺癌与癌旁组织比较，差异有显著性（P＜0.05）。见表2。

表2 非小细胞肺癌和癌旁组织中Epo-R表达的平均光密度和阳性面积率（¯x±s）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of Epo-R in NSCLC and cancer side tissue（¯x±s）

3.MVD的检测 非小细胞肺癌组MVD为28.60±7.63，癌旁组织 MVD为16.18±6.53。MVD与Epo-R等级相关分析，发现 MVD与Epo-R两者的表达呈正相关。Spearman等级相关系数为0.457（P＜0.01）。

讨 论

EPO及其受体EPOR是促进哺乳动物红系祖细胞增殖和分化的主要细胞因子。近年来，随着对人和动物的EPO分子克隆以及EPOR的突变体分析，对EPO与EPOR的相互作用及其信号转导路径有了比较深入的了解。人类EPO基因位于7号染色体长臂22区，有多肽和糖基构成，相对分子质量约34×103，含有2个二硫键、一个碳末端的精氨酸（Arg）残基［3］。细胞内无任何形式的EPO贮备，组织缺氧是刺激EPO合成释放的主要因素，缺氧可直接通过诱导EPO基因的转录来调控EPO的表达，这一机制最主要的调节因子是低氧诱导因子-1（hypoxiainducing factor-1，HIF-1）［4］。以往认为，EPOR仅存在于早期红系细胞，而近年来大量研究发现，在很多非造血组织和细胞中，如神经系统、心血管系统、内皮细胞、胰腺、肺、肝脏、肾脏、子宫、实质瘤等也有EPOR的表达。近年来大量的研究发现EPO具有抗炎、抗凋亡、神经保护等非促红细胞生成作用，而其功能的发挥依赖EPO／EPOR信号转导机制，亦称为经典理论［5-7］。该理论认为EPOR介导的EPO生物学效应的发挥依赖EPO与EPOR结合后EPO诱导Jak2磷酸化。本研究通过免疫组织化学方法检测了Epo／Epo-R在非小细胞肺癌中的表达，结果：Epo／Epo-R在非小细胞肺癌中的表达明显高于癌旁组织。图像分析结果显示：两组间差异有显著性意义（P＜0.05）。提示：在非小细胞肺癌组织中表达EPO和EPOR可能是一种较为普遍的现象，二者在肿瘤组织中高表达提示EPO-EPOR信号途径可能参与了肿瘤的恶性生物学行为；而EPO、EPOR在非小细胞肺癌组织中过表达，提示EPO、EPOR在非小细胞肺癌的发生、发展过程中可能起重要作用。关于EPO在肿瘤组织高表达的机制目前认为与缺氧有关。恶性肿瘤组织生长代谢旺盛，导致部缺氧和坏死是实体肿瘤内部的一种常见特征［8-10］，缺氧条件导致 HIF-1的水平升高，HIF-1的过表达诱导许多与肿瘤缺氧有关的基因的表达［11］，EPO是其效应分子之一，因而表达升高。肿瘤发生、侵袭、转移能力与肿瘤的促血管形成密切相关［12］。研究表明［13］，肿瘤直径达1-2mm 后，要继续发展，必须有足够的营养供应，这样便需要形成供应肿瘤生成的新生血管。肿瘤血管的新生，一方面为肿瘤生长提供营养，另方面增加了血管的通透性，有利于肿瘤细胞转移［14］。本实验还观察到：在非小细胞肺癌中Epo／Epo-R表达阳性者，MVD计数显著高于癌旁组织Epo／Epo-R表达阴性者（P＜0.05）。非小细胞肺癌中高表达 Epo／Epo-R，与MVD呈正相关关系。提示：Epo／Epo-R在非小细胞肺癌中的促进新生血管形成的作用。肿瘤微血管数量愈多，肿瘤细胞进入血液循环的机会愈大。持续无规则的新生血管的形成促进了肿瘤的生长、侵袭与转移。可见EPO-R在人类肿瘤细胞中表达具有重要作用，可以调节肿瘤细胞的生长发育，引起恶性肿瘤新生血管的生长。而新生血管管壁薄弱，发育欠佳，可能是恶性肿瘤细胞血行转移的原因之一。同时实验中对Epo／Epo-R与 MVD的关系研究分析发现两者呈正相关（P＜0.01），而Epo／Epo-R阳性表达患者的MVD明显高于Epo-R阴性表达患者的 MVD，更支持Epo／Epo-R表达与 MVD是相关的，说明Epo／Epo-R与肿瘤微血管的生成有密切的关系。因此，如果联合检测Epo-R和MVD多项指标，可以更好地分析判断患者的临床病理特征。MVD是衡量血管生长的定量指标。也可提供一条治疗恶性肿瘤的新思路，即针对抗肿瘤血管形成及促进因子的作用，抑制非小细胞肺癌组织中的血管形成，为恶性肿瘤靶向治疗提供新途径。

［1］Paoin W.Lessons Learned from Data Mining of WHO Mortality Database.Methods Inf Med.2011，21；50（4）：4876-4882

［2］Arcasoy MO.Erythropoiesis-estimulating agent in cancer：preclinical and clinical perspectives.Clin Cancer Res，2008，14（15）：4685-4690

［3］BuemiM，Cavallaro E，Floccari F，et al.Erythropoietin and the brain：from neurodevelopment to neurop rotection.Clin Sci，2002，103（3）：275-282

［4］Phillips TM，Kim K，Vlashi E，et al.Effects of recombinant Erythropoietin on breast cancer-initating cells.Neoplasia.2007；6（12）：1122-1129

［5］Lai SY，Childs EE，Xi S，et al.Erythropoiesis-mediated activation of JAK-STAT signaling contributes to celluar invasion in head and neck squamous cell carcinoma.Oncogene.Mannello Phillips Lai Mohyeldin，2005，24（27）：4442-4448

［6］Mohyeldin A，Lu H，Dalgard C，et al.Erythropoietin signalling promotes invasiveness of human head and neck squamous cell carcinoma.Neoplasia，2005，7（5）：537-543

［7］Sinclair AM，Todd MD，Forsythe K，et al.Expression and function of erythropoietin receptors in tumors：implications for the uses of erythropoiesis-stimulating agents in cancer patients.Cancer，2007，110 （3）：477-488

［8］Sinclair AM，Rogers N，Busse L，et al.Erythropoietin receptor tanscription is neither elevated nor predictive of surface expression in human tumor cells.Br J Cancer，2008，98（6）：1059-1067

［9］Shannon AM，Bouchier-Hayes DJ，Condron CM，et al.Correction of anaemia through the use of darbepoetin alpha improves chemotherapeutic outcome in a murine model of Lewis lung carcinoma.Br J Cancer，2005，93（2）：224-232

［10］Vaupel P，Schlenger K，Knoop C，et al.Oxygenation of human tumors：evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2tension measurements.Cancer Res，1991，51：3316-3322

［11］Guillemin K，Krasnow M A.The hypoxic response：huffing and HIFing.Cell.1997，89：9-12

［12］Gupta K，Zhang J.Angiogenesis：accurse or cure ？Post Med J，2005，81（954）：236-242

［13］ZagZag D.Angiogenic growth factors in neural embryogenesis and neoplasia.Am J Pathol，1995，146（2）：293-309

［14］李占霞，杨翔，张国锋.结肠癌抗血管生成治疗研究进

展.中国普通外科杂志，2006，15（9）：707-709

图 版 说 明

图1 EPO的表达 非小细胞肺癌：胞膜及胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒，EPO呈阳性表达（➨）.HE×200

图2 EPO的表达癌旁组织：癌旁组织细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，EPO呈阴性表达（➨）.HE×200

图3 Epo-R的表达 非小细胞肺癌：胞膜及胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒，Epo-R呈阳性表达（➨）.HE×200

图4 Epo-R的表达 癌旁组织：癌旁组织细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，Epo-R呈阴性表达（➨）.HE×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The expression of EPO NSCLC group：There were plenty of brown particles in the membrane or cytoplasm，which showed EPO expressed positive.S-P×200

Fig.2 The expression of EPO cancer side tissue.There were few brown particles in the membrane or cytoplasm，which showed EPO expressed negative.S-P×200

Fig.3 The expression of EPO-R NSCLC group：There were plenty of brown particles in the membrane or cyto-plasm，which showed EPO-R expressed positive.S-P×200

Fig.4 The expression of EPO-R cancer side tissue.There were few brown particles in the the membrane or cytoplasm，which showed EPO-R expressed negative.S-P×200

Expression and signifrcance of erythropoietin／erythropoietin receptor（Epo／Epo-R）in non-small cell lung cancer（NSCLC）and the relation with microvessel density（MVD）

Tang Tian，Shan Guang1＊
（1Department of Oncology，Renmin Hospital of Wuhan University；2Department of Urology，Renmin Hospital of Wuhan university，Hubei 430060，China）

ObjectiveTo explore the expression of Epo／Epo-R in non-small cell lung cancer（NSCLC）and relation with microvessel density（MVD）.MethodsSpecimens from 40cases（28males and 12females，from 2008to 2010）of non-small cell lung cancer from Pathology Department in Renmin Hospital of Wuhan University were collected.The expression levels of Epo／Epo-R were detected by immunohistochemical S-P staining in the 40specimens of non-small cell lung cancer and adjacent tissues.Average optical density and positive area expression rates of Epo／Epo-R were measured by image analysis（HPIAS-1000）.Statistical evaluations for average optic density and positive area rate of immunohistochemical reaction were performed by using one-way ANOVA and q-test.All data were processed by SPSS11.5.We also detected the microvessel density（MVD）and analysis the relationship with clinical pathology.ResultsThe expression of Epo／Epo-R in NSCLC was significantly higher than that in normal adjacent tissue，and image analysis showed significant differences between the expression of Epo／Epo-R in non-small cell lung cancer and that in adjacent tissues（P＜0.05）.The MVD in Epo／Epo-R positive patients was significantly hight than that in Epo／Epo-R negative patients（P＜0.05）.ConclusionEpo／Epo-R in non-small cell lung cancer is highly expressed and positively correlated with MVD，so the joint detection of Epo／Epo-R and MVD is more conducive to correctly judge the clinical and pathological features of disease and prognosis.

Non-small cell lung cancer；Epo／Epo-R；MVD；Immohistochemistry

R734.2

A

10.3870／zgzzhx.2011.05.012

2011-04-10

2011-08-01

唐甜，女（1981年）汉族，博士，主治医师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）