大鼠肝癌发生过程中NF-κB的表达

李京敏 李笑岩 宁巍巍 王 东 白咸勇＊

大鼠肝癌发生过程中NF-κB的表达

李京敏1李笑岩2宁巍巍2王 东2白咸勇2＊

（1滨州医学院人体解剖与组织胚胎学研究所；2滨州医学院组织学与胚胎学教研室 山东烟台264003）

目的 探讨核转录因子-κB（NF-κB）在大鼠肝癌发生发展中的作用和意义。方法 应用免疫组织化学SP法，对二乙基亚硝胺（DEN）诱发的大鼠肝癌发生过程中NF-κB的动态表达进行了检测。结果 DEN诱发的肝癌为肝细胞癌，诱癌率为100%，大鼠肝癌癌变过程大致经过肝细胞损伤期、肝细胞增生-硬化期和肝细胞癌变期等三个阶段。在正常大鼠肝组织，偶见少量肝细胞呈阳性表达，随着肝癌发生发展，NF-κB阳性表达细胞逐渐增多，至诱癌晚期，可见大量NF-κB阳性表达细胞，均比正常肝组织表达高（P＜0.05）。结论 本研究表明肝细胞NF-κB的过度表达与肝癌的发生和发展密切有关。

NF-κB；肝癌发生；免疫组织化学；大鼠

核转录因子-κB（NF-κB）广泛存在于真核细胞中，具有广泛的生物学活性，通过调控众多基因的表达来调节机体的免疫应答、细胞增殖、细胞死亡和炎症反应，其表达异常会导致机体发生各种病理改变。近年来研究发现，NF-κB通过调控靶基因的转录还参与肿瘤发生过程中的细胞存活、增殖、血管生成、恶变、炎症和凋亡抑制［1］。本实验采用二乙基亚硝酸胺（diethylnitrosamine，DEN）建立大鼠诱发性肝癌模型，模拟人体肝癌发生发展的过程，探讨NF-κB在肝癌发生发展过程中的表达变化及作用，为阐明肝癌发生发展的机制提供实验依据，为肝癌的早期诊断和特异性药物开发提供新思路。

材料和方法

1.材料

清洁级雄性 Wistar大鼠150只，体重150-200g，购自山东大学实验动物中心；二乙基亚硝胺，购自Sigma公司；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体，购自北京博奥森公司；正常羊血清、兔二步法检测试剂盒购自北京中杉金桥公司；DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司。

2.肝癌动物模型的制作

将150只雄性Wistar大鼠随机分为模型组（135只）和对照组（15只）。模型组饲以含DEN（80ppm）饮水，连续12周后改为自由饮水；对照组给予常规自由饮水。于实验的第4、8、12、16、18、20、22、24、25周，随机选择模型组大鼠10-15只断头处死，大体观察并记录肝脏的形态、颜色、质地变化后，取肝组织，4%多聚甲醛缓冲液固定，常规石蜡包埋，3μm连续切片，HE染色，光学显微镜下观察肝组织病理学变化。

3.NF-κB免疫组织化学染色（SP法）

主要操作步骤：将厚度3μm组织切片常规脱蜡至水；3%过氧化氢甲醇处理30min以灭活内源性过氧化物酶；柠檬酸缓冲液微波修复10min；正常羊血清封闭30min以减少非特异性染色；滴加兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体，4℃过夜，以PBS代替一抗作阴性对照；滴加生物素标记羊抗兔IgG孵育30min；DAB显色，冲洗；脱水，透明；封片。

阳性结果判断标准：光学显微镜下观察，细胞质或胞核内有弥漫分布的棕黄色颗粒沉积。图片采用IMAGE-PROPLUS图像分析系统进行分析，结果以平均光密度值表示。

4.统计学处理 实验数据以均数±标准差（¯x±s）形式表示，采用SPSS13.0软件包进行单因素方差分析和Bonferroni法两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.诱癌过程中大鼠肝脏的病理学变化

对照组大鼠：

肝脏肉眼观未见明显异常；光镜下肝组织结构正常，肝细胞排列呈索状，围绕小叶中央静脉呈放射状排列。肝细胞浆嗜酸性，核嗜碱性，多为单核，位于细胞中央（图1A）。

模型组大鼠：

肝脏病理学变化可大致归纳为3期：①肝细胞损伤期（诱癌第1-8周）：肉眼观肝脏未见明显异常；光镜下肝细胞肿胀，部分呈嗜酸性变。肝小叶结构尚完好，小叶内可见灶性坏死并伴有炎性细胞浸润，逐渐出现纤维组织增生及肝细胞再生（图1B）。②增生硬化期（诱癌第9-16周）：肝脏表面出现弥散分布的灰白色结节；镜下可见嗜酸性或透明细胞增生灶，并形成肝细胞增生结节，结节内的细胞异型性较小（图1C）。③癌变期（诱癌第17-25周）：肝脏表面布满大小不等的灰白色结节，切面可见出血和坏死；镜检组织学类型主要为肝细胞肝癌，癌细胞排列成梁索状或团块状向周围组织浸润，癌周组织细胞水肿、嗜酸性变、脂肪变性，并有肝细胞增生（图1D）

2.诱癌过程中NF-κB的表达

NF-κB免疫阳性产物定位于细胞核，阳性细胞可见胞核内有弥散分布的棕黄色颗粒沉积。在正常大鼠肝组织，偶见少量肝细胞呈阳性表达，随着肝癌的发生进程，NF-κB阳性表达的细胞逐渐增多，至诱癌晚期，可见大量NF-κB阳性表达细胞，在癌组织内成团高表达，可见明显界限。

表1 大鼠肝癌发生过程中NF-κB的表达（¯x±s）Table 1 The expression of NF-κB during hepatocarcinogenesis in rats（¯x±s）

图1 诱癌过程中大鼠肝脏病理学变化（HE染色 ×100）1A：正常肝组织；1B：损伤期；1C：增生硬化期；1D：癌变期Fig.1 The pathological changes of liver tissues during hepatocarcinogenesis in rats（HE stainning×100）1A：Normal liver tissues；1B：Hepatic toxic lesion stage；1C：Hepatic proliferation／cirrhosis stage；1D：Hepatic carcinogenesis stage

图2 大鼠肝癌发生过程中NF-κB的表达（SP法 ×400）2A：正常肝组织；2B：损伤期；2C：增生硬化期；2D：癌变期Fig.2 The expression of NF-κB during hepatocarcinogenesis in rats（SP method× 400）2A：Normal liver tissues；2B：Hepatic toxic lesion stage；2C：Hepatic proliferation／cirrhosis stage；2D：Hepatic carcinogenesis stage

讨 论

肝癌是由病毒、化学致癌物等多种病因作用，由癌基因或癌相关基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新复活等诸多因素引起肝细胞生长失控而致癌变，经启动、促进、演变多阶段的发病过程，并与基因调控和表达等密切相关［2］。多基因、多阶段癌基因或抑癌基因的变异，构成肝癌发生、发展的分子基础［3］。NF-κB家族由 Rel蛋白家族成员组成，以同源或异源二聚体形式存在，其N端均有一段保守的约含300个氨基酸残基的Rel同源结构域（rel homology domain，RHD），该结构域包含与抑制性蛋白（IκB）结合的位点和Rel蛋白间聚合位点，同时也含有DNA识别序列及核定位序列（nuclear localization signal，NLS）［4］。 正 常 情 况 下，NF-κB主要位于胞质内，与IκB结合，处于非活性状态。当受到细胞因子等刺激因子作用后，IκB激酶复合物（IKK）被激活，与 NF-κB结合的IκB被IKK 磷酸化，发生多泛素化，与泛素结合后的IκB发生构象改变，可被蛋白酶识别并降解，此时NF-κB游离并转入核内，调节下游基因的表达，进而发挥抑制细胞凋亡、诱导细胞恶性转化、促进肿瘤侵袭转移及对化学药物耐药等作用［5］。

Pikarsky等［6］研究发现，NF-κB在促进炎症相关性肝癌的发生中起重要作用。王以浪等［7］通过检测35例肝癌灶组及其自身对照的非癌组织NF-κB的表达，分析NF-κB表达与HBV复制及临床病理学特征之间的关系，发现癌组织NF-κB表达强度明显高于癌周组织，NF-κB信号通路的过度激活与HBV相关性肝细胞肝癌形成密切相关。本研究结果发现在正常大鼠肝组织，偶见少量肝细胞呈NF-κB阳性表达，随着肝癌发生进程，NF-κB阳性表达细胞逐渐增多，至癌变晚期，癌团中存在NF-κB广泛高表达及异常激活，提示活化后的NF-κB通过调节相应靶基因的表达，如上调抗凋亡基因Bcl-2，从而促进癌细胞存活、增殖、侵袭以及肿瘤血管生成，在肝癌的发生发展中发挥了的重要作用；肝细胞中NF-κB的表达随着肝癌发生发展而进行性增加，也反映了肝细胞的早期恶性转化及恶变程度，提示NF-κB可以作为肝癌早期诊断的指标。NF-κB信号通路与众多信号通路相互调控，在调控肿瘤发生发展及凋亡的复杂信号网络中处于核心环节［8，9］，据此我们认为可以研究设计以NF-κB为特异靶点的肝癌治疗方案，通过抑制NF-κB的活性，以降低肝癌化疗的耐药性，提高治疗效果。

［1］Baud V，Karin M.Is NF-kappaB a good target for cancer therapy？Hopes and pitfalls.Nat Rev Drug Discov，2009，8（1）：33-40

［2］Li Q，Withoff S，Verma IM.Inflammation-associated cancer：NFkappaB is the lynchpin.Trends Immunol，2005，26：318-325

［3］Thorgeirsson SS，Grisham JW.Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma.Nat Genet，2002，31：339-346

［4］高航，何松 .核转录因子-κB与肝癌的关系 .中华肝脏病杂志，2007，15（8）：637-638

［5］Moynagh PN.The NF-kappa B pathway.J Cell Sci，2005，118：4589-4592

［6］Pikarsky E，Porat RM，Stein I，et al.NF-kappaB functions as a tumour promoter in inflammation-associated cancer.Nature，2004，431（7007）：461-466

［7］王以浪，姚登福，吴玮，等 .肝癌组织核转录因子-κB表达与HBV复制及其临床病理学特征 .世界华人消化杂志，2009，17（3）：265-269

［8］Karin M，Greten FR.NF-kappaB：linking inflammation and immunity to cancer development and progression.Nat Rev Immunol，2005，5：749-759

［9］Sergei I，Grivennikov，Michael K.Dangerous liasons：STAT3andNF- κB collaboration and crosstalk in cancer.Cytokine Growth Factor Rev，2010，21（1）：11-19

Expression of NF-κB during hepatocarcinogenesis in rats

Li Jingmin1，Li Xiaoyan2，Ning Weiwei2，Wang Dong2，Bai Xianyong2＊
（1Institute of Human Anatomy and Histology and Embryology，Binzhou Medical College；2Department of Histology and Embryology，Binzhou Medical College，Yantai，Shandong264003，China）

ObjectiveTo discuss the role and significance of nuclear factor-κB（NF-κB）during hepatocarcinogenesis in rats.MethodsThe dynamic expression of NF-κB during hepatocarcinogenesis induced by diethylnitrosamine（DEN）in rats was investigated by immunohistochemical SP method.ResultsHepatocellular carcinoma was induced by DEN in all cases.The process of hepatocarcinogenesis in this model included three stages：hepatic toxin lesion，hepatic proliferation／cirrhosis，and hepatic carcinogenesis.An increasing tendency of NF-κB expression was shown from normal liver to precancerous to cancerous tissues with the progress of rat hepatocarcinogenesis，and a large number of NF-κB positive cells were shown at the terminal cancer stage，compared to the lower expression in normal liver tissues（P＜0.05）.Conclusion The results suggest that the overexpression of NF-κB in hepatocytes is related closely to the occurrence and progression of hepatoma.

NF-κB；Hepatocarcinogenesis；Immunohistochemistry；Rat

R329

A

10.3870／zgzzhx.2011.05.007

2010-12-27

2011-06-27

山东省优秀中青年科学家科研奖励基金（01BS51）

李京敏，女（1983年），汉族，硕士。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）